微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及錯配修復(fù)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌化療療效相關(guān)性的研究

馮強(qiáng)，孫琦，孫霞，吳丹，秦磊

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院 肛腸外科，江蘇 江陰 214400；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 江陰 214400；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普通外科，江蘇 蘇州 215000)

結(jié)直腸癌(CRC)是我國最為常見的惡性腫瘤之一[1]；錯配修復(fù)(MMR)蛋白表達(dá)及微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)與CRC的發(fā)病存在著明顯的相關(guān)性[2-3]。正常情況下，人體內(nèi)的MMR基因所表達(dá)產(chǎn)生的MMR蛋白存在自動修復(fù)上述MSI的功能。然而由于MMR基因自身的缺陷，造成MMR蛋白錯配修復(fù)功能喪失，基因不穩(wěn)定性概率增加，在細(xì)胞復(fù)制過程中，基因錯配的機(jī)率也隨之增加，從而引起MSI，造成腫瘤的發(fā)生。由此可見，MMR與MSI之間存在密切聯(lián)系[4-5]。

近年來有研究者發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合其他化療藥物，尤其是加入含奧沙利鉑的化療方案，會改變MMR蛋白表達(dá)缺失(dMMR)/微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(MSI-H)患者對輔助化療的敏感性。如Zaanan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期MSI-H的CRC患者接受奧沙利鉑和5-FU輔助化療的效果比微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定(MSI-L)或穩(wěn)定的CRC患者要好。鑒于既往研究結(jié)果，本研究擬采用熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測腸癌組織中MSI分型，再用免疫組化法(IHC)檢測CRC組織中MMR蛋白的表達(dá)情況，分析 MSI表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證MMR蛋白表達(dá)與MSI分型的一致性，從而了解它們對CRC精準(zhǔn)化及個體化治療的指導(dǎo)意義，為 MSI分型檢測篩選合理的檢測方法。同時觀察采用不同化療方案的不同分期、不同MSI分型患者無進(jìn)展生存期(PFS)之間的差異，從而評判不同化療方案對CRC的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

CRC組織標(biāo)本取自2013年10月至2016年10月在東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院肛腸外科手術(shù)切除的石蠟組織標(biāo)本，所有患者均為手術(shù)病理確診(由至少兩名主治醫(yī)師以上病理科醫(yī)師確診)且病理資料和臨床資料完整、術(shù)前未經(jīng)化放療和分子靶向治療的初診患者。CRC組織標(biāo)本共130例，男75例(57.69%)，女55例(42.3%)；年齡25～85歲，平均61歲；腫瘤位于右半結(jié)腸27例(20.7%)，左半結(jié)腸26例(20%)，直腸77例(59.3%)；Ⅱ期91例(70%)，Ⅲ期39例(30%)。 選擇癌旁組織標(biāo)本10例作為對照，標(biāo)本經(jīng)HE染色證實(shí)為正常結(jié)直腸組織。組織標(biāo)本均經(jīng)40 g·L-1甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每例石蠟標(biāo)本以4 μm厚度連續(xù)切片5張。

1.2 主要試劑

一抗MLH1兔抗人抗體和hMSH2兔抗人抗體均為 SANTA CRUZ 公司產(chǎn)品。二抗：(1) MLH1兔單抗，克隆號ES05，即用型；(2) PMS2兔單抗，克隆號EP51，即用型；(3) MSH2兔單抗，克隆號FE11，即用型；(4) MSH6兔單抗，克隆號EP49，即用型。免疫組化EliVision plus試劑盒均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 MMR蛋白的免疫組化檢測

1.3.1 免疫組化檢測過程 采用免疫組化S-P法，參照EliVision plus試劑盒說明書進(jìn)行，具體如下：取各CRC組織，連續(xù)石蠟切片，58 ℃烘烤60 min，二甲苯脫蠟，然后水化，0.5%過碘酸處理后用PBS沖洗；接著浸入檸檬酸緩沖液修復(fù)液加熱，再用PBS沖洗；滴加3%雙氧水，再次PBS沖洗；最后滴加正常山羊血清封閉液；滴加一抗，結(jié)合抗原：每張切片上分別滴加hMLH1、hMSH2、TS抗體，37 ℃孵育65 min(hMLH1、hMSH2抗體稀釋1∶200，TS抗體稀釋1∶1 000)，放入4 ℃ 冰箱過夜；第2天復(fù)溫，PBS沖洗，依次滴加生物素標(biāo)化二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素溶液，PBS沖洗；最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，鏡下觀察切片。所有切片均以PBS代替一抗作為陰性對照，其他步驟同前。

1.3.2 免疫組化結(jié)果的判斷 每批標(biāo)本檢測時均設(shè)有空白對照(以PBS緩沖液代替一抗染色已知陽性切片)，結(jié)果由兩名主治醫(yī)師以上病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立重復(fù)閱片，所有染色切片均在光鏡下觀察，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)掃描后保存。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用圖像分析軟件(Image-proplus 6.0)統(tǒng)計(jì)計(jì)算。hMLH1陽性染色主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，部分細(xì)胞質(zhì)著色；hMSH2定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜不染色，間質(zhì)不染色。染色陽性結(jié)果表現(xiàn)為淺黃色、黃色或棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個高倍視野，按腫瘤細(xì)胞陽性比率評分：腫瘤細(xì)胞陽性率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度評分：沒有細(xì)胞著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。采用腫瘤細(xì)胞陽性率評分乘以腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度評分的方法綜合評分，兩者相乘，結(jié)果作為最終評分。根據(jù)最終評分，將MMR蛋白染色分為4個等級：0分為(-)，l～4分為(+)，5～8分為(++)，>8分為(+++)。片內(nèi)正常結(jié)直腸組織及間質(zhì)細(xì)胞無著色，作為陰性對照。判斷標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)對照細(xì)胞核陽性而癌組織全陰性(即沒有一個細(xì)胞核染色)時表示該蛋白表達(dá)缺失。

1.4 MSI的PCR檢測

1.4.1 基因組DNA抽提 采用Qiagen公司的DNA提取試劑盒按組織樣品DNA的提取步驟提取組織DNA，常規(guī)切片4 μm厚5～10張，經(jīng)脫蠟、蛋白酶K消化及離心，將DNA洗脫。稀釋DNA至濃度為20 ng·μl-1，體積為50 μl。一張HE染色觀察形態(tài)，其余用于下一步提取DNA；顯微鏡下觀察HE切片，選取富有腫瘤細(xì)胞的區(qū)域，對應(yīng)HE切片將腫瘤組織刮入裂解液，保證腫瘤成分80%以上。

1.4.2 PCR法擴(kuò)增 在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制20 μl PCR反應(yīng)體系，在標(biāo)本制備區(qū)加模板(待檢血液樣本、待檢腫瘤石蠟樣本)至反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)管振蕩混勻，短暫離心。在擴(kuò)增區(qū)按以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增： PCR反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，溫度降至10 ℃結(jié)束。以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對照，以已知陽性病例作為陽性對照。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μl，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增結(jié)束后擬對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.4.3 對PCR產(chǎn)物測序 將DNA PCR產(chǎn)物(20 μl)磁珠純化，配制測序反應(yīng)體系，總反應(yīng)體積5 μl，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心后將PCR管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。接著反應(yīng)產(chǎn)物醋酸鈉純化后上ABl3730 DNA Analyzer進(jìn)行PAGE電泳。采用Sequence Analysis軟件進(jìn)行序列分析。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察130例患者的MSI分型、MMR蛋白表達(dá)情況。將130例患者分為MSI-H組和非MSI-H組，觀察兩組間MMR蛋白表達(dá)缺失率的差異。同時收集130例患者的臨床及病理資料，觀察MSI-H組和非MSI-H組兩組的臨床病理特征的差異。最后分析術(shù)后不同輔助化療方案組(FOLFOX4組、XELOX組、未化療組)不同MSI分型、不同MMR蛋白表達(dá)者生存時間的差異。研究終點(diǎn)為無進(jìn)展生存時間(progress free survival，PFS)，是指從確診之日起至患者末次隨訪病情進(jìn)展的日期。最后一次隨訪至2018年8月30日。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0，用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，用Log Rank法檢驗(yàn)生存率的差別，計(jì)量資料以±s表示，獨(dú)立組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMR蛋白表達(dá)結(jié)果

4種MMR蛋白表達(dá)均定位于腫瘤細(xì)胞核，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6均陽性表達(dá)即為MMR表達(dá)未缺失，任何一種蛋白表達(dá)的缺失即為MMR表達(dá)缺失(圖1)。MMR蛋白陽性者(pMMR組)95例(73%)，表達(dá)缺失者(dMMR組)35例，缺失率為26.9%，其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6表達(dá)缺失者分別為15例(42.9%)、11例(31.4%)、6例(17.1%)及3例(8.6%)。

2.2 MMR蛋白表達(dá)與MSI表達(dá)的相關(guān)性

MSI的PCR檢測顯示，MSI-H的檢出率為23.8%(31/130)，而非MSI-H的檢出率為76.2%(99/130)(圖2、3、4)。在非MSI-H組中，MMR未缺失率占94.9%，而缺失率僅占5.1%；MSI-H組中，MMR未缺失率占3.2%，缺失率占96.8%。提示在CRC患者中，MSI-H與MMR蛋白缺失有一定的相關(guān)性(P<0.001)。

圖4 CRC的MSI-L:腫瘤組織的NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25和BAT-26位點(diǎn)結(jié)果分析

2.3 MSI表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

非MSI-H與MSI-H組患者年齡、性別、部位、分期比較結(jié)果顯示，兩組間差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示兩組患者各病理特征無明顯差異，見表1。

表1 非MSI-H與MSI-H組臨床病理特征的比較

2.4 MSI表達(dá)水平與PFS的關(guān)系

對術(shù)后不同輔助化療方案組(FOLFOX4組、XELOX組、未化療組)就不同MSI分型與不同MMR蛋白表達(dá)的亞組進(jìn)行Log Rank生存分析顯示：在FOLFOX4組中，不同MSI分型、不同MMR蛋白表達(dá)亞組患者的PFS為2～41個月，平均16.7個月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。在XELOX組中，上述兩亞組患者的PFS為2～46個月，平均14.6個月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.175)；在未化療組中，上述兩亞組患者的PFS為1～40個月，平均19.2個月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.442)。見圖5。對FOLFOX4、XELOX及未化療組間進(jìn)行比較顯示，F(xiàn)OLFOX4組中MSI-H患者的復(fù)發(fā)時間要短于非MSI-H患者。

圖5 各化療方案組中不同患者的PFS曲線圖

3 討 論

CRC是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的異質(zhì)性疾病，發(fā)病率和死亡率較高[7]。目前，MSI作為預(yù)判CRC患者能否在CRC輔助治療中獲益的指標(biāo)已經(jīng)成為了研究的熱點(diǎn)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，非MSI-H 組中MMR未缺失率占94.9%，缺失率僅占5.1%，而MSI-H 組中MMR未缺失率占3.2%，缺失率占96.8%，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了MMR蛋白表達(dá)與MSI分型的一致性，為MSI分型檢測篩選合理的檢測方法。

大量研究表明，MSI-H的CRC患者預(yù)后相對好，具有更高的生存率，然而對5-FU單藥治療卻不敏感[8]。這已在2011年的NCCN指南中被提及。近年來有研究者[9]發(fā)現(xiàn)，5-FU聯(lián)合其他化療藥物會改變MSI-H患者對輔助化療的敏感性，尤其是加入含奧沙利鉑的化療方案。臨床上多采用FOLFOX或XELOX化療方案，因此了解MSI的CRC患者接受FOLFOX或XELOX化療的生存預(yù)后，為CRC患者的個體化治療提供可能的理論依據(jù)。本研究回顧性分析 MSI-H患者的臨床病理特征，通過對接受FOLFOX或XELOX化療的患者進(jìn)行生存預(yù)后分析，判斷MSI-H患者對化療療效的預(yù)測價值。我們發(fā)現(xiàn)，不同MSI狀態(tài)的CRC患者在不同的術(shù)后輔助化療后，其生存期是不同的。

目前對MSI-H患者與非MSI-H患者相比較，是否能從FOLFOX化療方案中獲益仍然存在爭議[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在FOLFOX化療基礎(chǔ)上，總體MSI-H CRC患者的PFS比非MSI-H者差，與Zaanan等[6]的研究結(jié)果相似，而在XELOX方案化療及未化療患者中均未看到MSI-H組與非MSI-H組間PFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此可推斷加入奧沙利鉑可能會改變MSI-H對輔助化療療效的預(yù)測作用。同時本研究中我們發(fā)現(xiàn)，MSI-H的CRC患者能從XELOX方案獲益。因此，對于有化療指征的MSI-H型患者，我們更推薦XELOX方案的化療。但因本研究MSI-H的CRC樣本量小，且為回顧性研究，結(jié)果不一定客觀準(zhǔn)確，需待進(jìn)一步前瞻性研究加以論證。

總體來說，MSI可作為5-FU化療藥物敏感性預(yù)測的分子標(biāo)志物，MMR檢測對CRC(特別是Ⅱ期CRC)的個體化治療有重要的指導(dǎo)意義。在5-FU基礎(chǔ)上再加入其它化療藥物可能會改變MSI對化療療效的預(yù)測價值。但是迄今為止，有關(guān)MSI與具體化療方案療效相關(guān)性的數(shù)據(jù)仍較少，尚需要進(jìn)一步研究[13]。