微小RNA-215-5p靶向eIF2a負向調控結腸癌細胞增殖

秦寶山，郭云霞，韓莉

(鄭州人民醫院 消化內科,河南 鄭州 450000)

結腸癌的發生受多種分子通路的調控[1]。真核細胞翻譯起始因子2a(eIF2a)是近年關注到的與腫瘤進展有關的因子，其不僅能調節細胞的翻譯，還能促進腫瘤細胞的增殖及遷移[2-3]。近年學者研究發現腫瘤中存在多種微小RNA(miRNA)的異常表達[4]。miRNA是非編碼RNA，通過多種方式、在多個層面調控DNA構象的改變、RNA的轉錄、蛋白質的翻譯，主要作用特征是對靶基因的調控。我們應用生物信息學對影響結腸癌進展的miRNA進行篩選，選擇在結腸癌中罕見報道的微小RNA-215-5p(miR-215-5p)進行研究[3]，并應用TargetScan網站預測相關靶基因，篩選出與miR-215-5p具有結合位點的eIF2a進行實驗設計(圖1)[5]，并基于此開展研究，關注miR-215-5p與eIF2a的靶向關系，探討其對結腸癌細胞增殖的調控。

圖1 TargetScan顯示的miR-215-5p與eIF2a的結合位點

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年4月至2015年3月期間確診為結腸癌并行根治手術的患者55例。納入標準：(1) 有明確的病理診斷，符合WHO中的標準；(2) 為首診患者；(3) 臨床隨訪資料完整。排除標準：(1) 伴有風濕免疫性疾病或遺傳性疾病者；(2) 有林奇綜合征者；(3) 術前行放、化療者。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣>5 cm的正常結腸黏膜組織作為對照組。

1.2 細胞系

選擇人結腸癌SW480細胞系(購于上海中喬新舟生物公司)復蘇，在37 ℃、5%的CO2完全培養基中培養，3 d傳1代，在細胞為對數生長期時收集細胞并計數進行實驗，細胞密度約為5 000個·cm-2。

1.3 方法

1.3.1 miR-215-5p的檢測 應用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測miR-215-5p的表達。首先提取總RNA。引物由上海碧云天生物公司合成。miR-215-5p上游5′-TCACTGTGTGAACCGGACGTGTGTG-3′，下游5′-GCTAGCGTGGTTTTAAATCCGGT-3′。以U6作為內參，引物上游5′-GGCAGAAACGTGGAACCGGC-3′，下游5′-TTGGAACAGTGGGCAAATTCCG-3′。應用逆轉錄合成cDNA，擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個循環后進行延伸。于60 ℃采集信號。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-Ct對照(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct對照(校正樣品)]。

1.3.2 雙熒光素酶報告基因實驗 帶有eIF2a的野生型、突變型3′-UTR的質粒由吉瑪公司(中國，上海)合成。共轉染熒光素酶報告基因質粒及miR-215-5p mimics，檢測熒光素酶表達，觀察miR-215-5p與eIF2a的3′-UTR結合情況。

1.3.3 蛋白印跡實驗 構建空白對照組、空載體轉染組、miR-215-5p轉染組、miR-215-5p與eIF2a共轉染組，應用蛋白印跡實驗檢測eIF2a、Ki67的表達。試劑購自上海碧云天生物公司。以GAPDH作為內參。依次進行蛋白提取、濃度測定、變性、加樣、電泳、電轉及免疫雜交，取出膜加入發光液 3 min后顯影。以目的蛋白與GAPDH的比值作為相對量進行分析，應用Image J分析完成。嚴格實驗質控。

1.3.4 免疫組化實驗 Ki67和eIF2a濃縮液均購自蘇州睿瀛生物技術有限公司，應用免疫組化SP法檢測結腸癌中eIF2a(1∶150稀釋)、Ki67(1∶200)的表達。基于石蠟包埋組織，切取4 μm切片，按實驗步驟滴加一抗、二抗后行DAB顯色。切片由病理科醫師判讀，應用盲法，eIF2a陽性部位是腫瘤細胞的細胞質和(或)細胞膜，Ki67陽性部位是細胞核，以棕褐色為陽性。觀察切片中所有腫瘤組織的染色，在同一放大倍數(400倍)下隨機選擇5個區域進行計數，計數陽性細胞在同一視野內腫瘤細胞的比例，取平均值作為陽性率。Ki67的陽性率亦稱為增殖指數。

1.4 統計學處理

應用SAS 6.12進行分析，定量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗或配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(SNK法行兩兩比較)，率的比較應用卡方檢驗，相關分析應用Spearman相關分析，生存比較應用K-M生存分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料的特征

結腸癌患者共55例。男28例，女27例，年齡33～84歲，中位年齡61歲；高分化21例，中分化28例，低分化6例；淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移43例；有脈管癌栓10例，無脈管癌栓45例?；颊呓Y腸癌及癌旁組織的病理學改變如圖2。

圖2 結腸癌病理組織學改變

2.2 結腸癌組織中miR-215-5p表達變化

與對照組相比，觀察組組織中miR-215-5p的表達明顯下降，差異具有統計學意義(2.54±0.53vs3.02±0.34,t=6.554,P<0.05)，見圖3。

圖3 結腸癌患者腸組織中miR-215-5p的表達(qPCR法) A. 擴增曲線(qPCR法);B.結腸癌患者腸組織中miR-215-5p表達比較的柱狀圖

2.3 結腸癌不同臨床病理特征者miR-215-5p表達的比較

MiR-215-5p表達在不同腫瘤最大徑和浸潤深度組的差異有統計學意義(P<0.05)，而在不同性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結轉移和脈管癌栓組的差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 結腸癌不同臨床病理特征者miR-215-5p表達的比較

2.4 miR-215-5p表達的生存分析

術后對患者進行了5年隨訪，截止時間點為2020年1月31日。共生存25例，死亡26例，失訪4例。死亡患者術后生存時間為11～60個月，中位生存時間為45個月。K-M生存分析顯示，miR-215-5p的表達與生存時間有關(臨界值為2.54，χ2=6.33，P=0.006)。見圖4、表2。

2.5 觀察組miR-215-5p與eIF2a、Ki67的相關性

免疫組化檢測eIF2a陽性率為15%～85%，平均56.3%，相關分析顯示，miR-215-5p與eIF2a呈負相關性(r=-0.61，P=0.023)。Ki67陽性率為10%～95%，平均55.3%。相關分析顯示，miR-215-5p與Ki67呈負相關性(r=-0.60，P=0.032)。見圖5。

圖5 觀察組miR-215-5p與eIF2a、Ki67的相關性

2.6 eIF2a mRNA的3′UTR是miR-215-5p的直接靶點

構建含有野生型 mRNA 3′-UTR序列的pGL3-basic質粒(pGL3-eIF2a-WT)和miR-215-5p結合位點缺失的突變型eIF2a mRNA 3′-UTR序列的質粒(pGL3-eIF2a-MT)，分別與空載體轉染組、miR-215-5p轉染組的細胞進行培養，檢測熒光素酶的表達。結果顯示，miR-215-5p轉染組能引起轉染pGL3-eIF2a-WT的熒光素酶活性降低，而pGL3-eIF2a-MT的熒光素酶活性無明顯影響，即eIF2a mRNA的3′UTR是miR-215-5p的靶點。見圖6。

a P<0.05

2.7 miR-215-5p對結腸癌細胞系中eIF2a和Ki67表達的影響

應用qPCR對各組細胞系中miR-215-5p的表達進行驗證。蛋白印跡實驗檢測eIF2a和Ki67的表達，與空白對照組及空載體轉染組比較，miR-215-5p轉染組的eIF2a、Ki67表達下降，共轉染組能逆轉上述改變。見表3、圖7。

表3 不同組別細胞系中miR-215-5p和Ki67表達的比較

圖7 miR-215-5p對結腸癌細胞系中eIF2a和Ki67表達的影響

3 討 論

結腸癌臨床生物學進展較為復雜，部分患者對治療的反應性差。目前其發生發展的分子學機制不清楚。進一步探討腫瘤發生、發展、浸潤及轉移過程的機制[6]，尋找評價其進展的生物學指標，可能對尋找結腸癌治療的靶點有重要價值[7]。miRNAs的異常表達對結腸癌的進展有重要促進作用[8]，其不同亞型作用可能不同[9]。EIF2a分子質量為38 kDa[10]，由兩個相互移動的結構域組成，即N端為具有S1型寡核苷酸/寡糖結合折疊子(OB)結構域和α螺旋結構域，C端為α折疊結構域[11-12]。α亞基為調節亞基和功能位點，具有調節腫瘤細胞增殖的作用。EIF2a可能是結腸癌形成和進展時調控的關鍵因子，其常受控于多種上游的miRNA，活化后對下游多種信號起調控作用[13-14]。本研究應用Ki67作為標記增殖指標的因子，效果理想，能客觀反映其所標記細胞的特征。

本研究結果顯示，miR-215-5p在正常結腸黏膜中有一定的表達量，在結腸癌中的表達下降，提示miR-215-5p低表達是結腸癌形成的分子事件，miR-215-5p可能具有抑癌基因樣的作用。本研究miR-215-5p在不同腫瘤最大徑及浸潤深度組的表達差異有統計學意義，提示miR-215-5p低表達對腫瘤生長和侵襲具有一定的促進作用。本研究發現了miR-215-5p與eIF2a的靶向關系，提示二者具有通路作用，也證實了生物信息分析中二者結合位點的有效性。MiR-215-5p/eIF2a是結腸癌調控的關鍵分子[15]。本研究證實了此通路對結腸癌細胞的增殖具有調節作用，對結腸癌標本的組織學研究發現，miR-215-5p及Ki67與腫瘤最大徑的大小呈負相關，也提示了其對細胞增殖的調控作用。MiR-215-5p作為抑癌因子，miR-215-5p低表達預示著腫瘤具有較強的侵襲作用及較高的臨床分期，也預示著較高的淋巴道轉移風險[16]。MiR-215-5p對細胞增殖的調控與對細胞周期的作用有關。有研究認為，miR-215-5p可能對調節G0/G1期有一定作用，使腫瘤細胞增殖速度加快[17]。MiR-215-5p/eIF2a通路中，miR-215-5p可能是上游因子，調控eIF2a發揮細胞增殖的作用[18]。本研究證實了在結腸癌的發生發展過程中eIF2a可能對Ki67起到了一定的調控作用，并認為eIF2a是預測結腸癌惡性程度的重要指標[19]。當eIF2α被激活時，通過對Ki67標記的腫瘤細胞和相關蛋白的影響[20-21]，有效促進腫瘤細胞的增殖，但是其具體的作用途徑有待進一步研究。miR-215-5p對幼稚上皮細胞的轉化可能有一定調節作用。本研究發現，miR-215-5p的表達與生存時間有關，提示檢測miR-215-5p的表達對判斷預后可能有幫助，即miR-215-5p低表達患者的預后差，但是miR-215-5p的臨界值尚需要進行大檢本、多因素分析后明確。

總之，miR-215-5p靶向eIF2a負向調控結腸癌細胞的增殖，miR-215-5p低表達是腫瘤形成和進展的重要事件，miR-215-5p的表達與生存時間有關。基于miR-215-5p/eIF2a通路進行多種生物學調控的研究有助于進一步闡明結腸癌的發生和進展的相關機制。