miRNA-30e靶向5-LOX對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

毛士明，曹金強，汪萬國，鄭燦

(枝江市人民醫院 神經內科，湖北 枝江 443200)

再灌注損傷是缺血性腦卒中治療過程中的一個難題，深入探討缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷的機制對其治療有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度19～22個核苷酸的非編碼RNA，可以與信使RNA的3′端非翻譯區結合，介導轉錄后基因調控[1]。miRNA廣泛表達于人體各個組織和器官，在細胞增殖和分化、細胞周期、表觀遺傳學和免疫監控中起到重要作用[1]。miR-30e與機體免疫炎癥損傷密切相關[2]，可通過調控凋亡基因Bcl-2影響腦缺血后神經細胞損傷[3]。有研究發現，miR-30e可以通過改善自噬對心臟IR損傷有一定保護作用[4]。miR-30e在腦IR損傷中的作用和機制既往鮮有報道。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是白三烯生物合成的關鍵酶，與中樞神經系統炎癥性疾病有關[5]。5-LOX過表達可促進促炎細胞因子的產生，導致腦IR損傷后神經元損傷[6]。本研究采用生物信息學和雙熒光素酶報告基因技術分析miR-30e與5-LOX的靶向作用關系，通過大鼠實驗探討miR-30e在腦IR損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 miR-30e 激動劑(miR-30e agomir)、miR-30e 激動劑對照試劑、miR-30e 拮抗劑(miR-30e antagomir)、miR-30e 拮抗劑對照試劑、miR-30e模擬物、miR-30e抑制劑和5-LOX siRNA均購于上海吉瑪制藥技術有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑購于上海碧云天生物技術有限公司；TRIzol試劑、反轉錄試劑盒和2倍SYBR Green PCR Mastermix試劑盒均購于美國Sigma公司；BCA蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒均購于北京百奧萊博科技有限公司；5-LOX抗體和羊抗兔抗體購于美國Sigma公司；酶聯免疫吸附實驗試劑盒購于武漢博士德生物有限公司；二甲基亞砜、噻唑蘭(MTT)檢測試劑盒購于美國Sigma公司。主要儀器有腦立體定位儀(型號51700，美國Stoelting公司)、全自動發光儀(型號ACCESS2，美國貝克曼庫爾特公司)、酶標儀(型號SAF-680T，上海旦鼎國際貿易有限公司)、流式細胞儀(型號FACSCalibur，美國BD公司)。

1.1.2 細胞 PC12細胞購于上海復祥生物科技有限公司，用含有10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基，置于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞融合度達90%時，倒掉培養液，用0.125%胰蛋白酶消化細胞后1 000 r·min-1離心10 min，用細胞培養液懸浮細胞，接種于培養基中繼續培養。

1.1.3 實驗動物 成年雄性SD大鼠70只，體重250～300 g，購于北京維通利華實驗動物公司，合格證號SCXK(京)2012-003。將大鼠在溫度為(21±1)℃、濕度為(50±5)%、明暗周期為12 h/12 h的環境中飼養，允許自由攝食和飲水。

1.2 大鼠腦IR損傷模型的建立

參照文獻[7]方法建立大腦中動脈閉塞再灌注模型。用100 g·L-1水合氯醛溶液(3 ml·kg-1)腹腔注射麻醉后分離頸總動脈分叉、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈和頸總動脈近心端，隨后用動脈夾夾閉頸總動脈遠心端。在頸總動脈分叉上2 mm處開一小口，將尼龍線栓緩慢插入頸總動脈，調整頭端方向，感覺有突破感時說明進入顱內。繼續推進20 mm，感到有阻力時停止。將頸內動脈遠心端的預留線系緊，剪去線頭。術畢逐層縫合皮膚。缺血2 h后拔出線栓，若大鼠出現明顯的局灶神經功能缺損例如一側傾倒，說明造模成功。本研究大鼠均造模成功。

1.3 大鼠分組及干預

將大鼠隨機分為7組各10只：(1) 假手術組，僅做頸部切口，無IR損傷;(2) 模型組，建立腦IR損傷模型；(3) 載體組，建立IR損傷模型，用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理水干預；(4) miR-30e激動劑組，建立IR損傷模型，用miR-30e激動劑干預；(5) 激動劑對照組，建立IR損傷模型，用激動劑對照試劑干預；(6) miR-30e拮抗劑組，建立IR損傷模型，用miR-30e拮抗劑干預；(7) 拮抗劑對照組，建立IR損傷模型，用拮抗劑對照試劑干預。3～7組大鼠均進行側腦室注射(前囟后1 mm，向右旁1.4 mm，硬腦膜下4.0 mm[8])，將miR-30e激動劑、激動劑對照試劑、miR-30e拮抗劑、拮抗劑對照試劑溶于DEPC處理水中，稀釋至100 μmol·L-1，注射體積為10 μl。干預24 h后進行神經功能評分：無明顯神經功能缺損為0分，提尾巴時動物左前肢屈曲不能伸直為1分，行走時向左側轉圈、靜息時可維持平衡為2分，行走時向偏癱側傾倒為3分，無可見活動為4分[9]。評估結束后處死大鼠。

1.4 大鼠腦梗死體積檢測

處死大鼠后迅速取腦，用切片機切成5個冠狀切片，厚度約2 mm。用2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色30 min，然后浸泡于4%多聚甲醛過夜。梗死組織為白色，正常腦組織為紅色。梗死體積(%)=缺血區重量/總重量。

1.5 實時定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

用TRIzol試劑和反轉錄試劑盒提取大鼠皮質梗死周圍區組織中的總RNA，隨后反轉錄為cDNA。使用2倍SYBR Green PCR Mastermix試劑盒檢測miR-30e與5-LOX mRNA的相對表達量。PCR反應條件為：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃、20 s，共40個循環。用2-ΔΔCq法計算基因相對表達量。

1.6 蛋白質印跡實驗

用RAPI裂解液提取大鼠皮質梗死周圍區組織中總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗5-LOX(1∶1 000)4 ℃過夜孵育，第2天除去一抗，用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗(羊抗兔，1∶500)，封閉1 h。以β-肌動蛋白作為內參，用ECL發光儀對蛋白成像，Image J軟件分析灰度值。

1.7 酶聯免疫吸附試驗

操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，酶標儀在450 nm波長下檢測半胱氨酸白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLT)和白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)的OD值，繪制標準曲線后計算濃度。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

應用Targetscan和MiRDB軟件預測miR-30e和5-LOX的結合位點。構建野生型(psiCHECKTM-2-5-LOX-wt)和突變型(psiCHECKTM-2-5-LOX-mut)報告載體，轉染至293T細胞中，再用miR-30e 模擬物或抑制劑進行干預。實驗分為以下7組：(1) 僅將空載體組轉染至293T細胞中，設為psiCHECKTM-2組；(2) 將 陰性對照序列轉染入含有野生型空載體的293T細胞中，設為5-LOX-Wt+NC組；(3) 野生型報告載體轉入293T細胞中，用miR-30e 模擬物干預，設為5-LOX-Wt+mimic組；(4) 野生型報告載體轉入293T細胞中，用miR-30e 抑制劑干預，設為5-LOX-Wt+inhibitor組；(5) 將陰性對照序列轉染入含有突變型空載體的293T細胞中，設為5-LOX-Mut+NC組；(6) 將突變型報告載體轉入293T細胞中，用miR-30e 模擬物干預，設為5-LOX-Mut+mimic組；(7) 將突變型報告載體轉入293T細胞中，用miR-30e抑制劑干預，設為5-LOX-Mut+inhibitor組。psiCHECKTM-2載體能同時表達腎素熒光素酶和螢火蟲熒光素酶。miR-30e與5-LOX-Wt載體的結合作用可降低腎素熒光素酶，而非螢火蟲熒光素酶的表達。細胞轉染24 h后收集細胞，用PromegaE1910雙螢光素酶報告基因檢測系統測定螢火蟲和腎素熒光素酶的活性。

1.9 細胞缺氧復氧損傷模型建立及干預

轉染mimic或inhibitor后，建立缺氧-葡萄糖剝奪和復氧(oxygen glucose deprivation and reoxygenation，OGDR)損傷模型。將PC12細胞在缺氧(1%O2、94%N2和5%CO2)室中培養12 h，隨后在正常條件下培養4 h[10]。根據處理條件不同將細胞分為以下幾組：(1) 常 氧組，細胞在正常氧氣條件下培養；(2) OGDR組，建立OGDR損傷模型，但不進行干預；(3) mim-miR-NC組，建立OGDR損傷模型，用miR-30e模擬物對照試劑干預；(4) mim-miR-30e組，建立OGDR損傷模型，用30 μmol·L-1miR-30e mimic干預；(5) mim-miR-30e+si-5-LOX組，建立OGDR損傷模型，用30 μmol·L-1miR-30e mimic和2 μmol·L-1si-5-LOX干預；(6) inh-miR-NC組，建立OGDR損傷模型，用miR-30e抑制劑對照試劑進行干預；(7) inh-miR-30e組，建立OGDR損傷模型，用100 nmol·L-1miR-30e inhibitor干預；(8) inh-miR-30e+si-5-LOX組，建立OGDR損傷模型，用100 μmol·L-1miR-30e inhibitor和2 μmol·L-1si-5-LOX干預。

1.10 細胞活力檢測

用MTT法檢測細胞活力，PC12細胞接種于96孔板，當細胞融合度達80%時進行如1.9中的細胞干預。隨后每孔加入20 μl的MTT液，37 ℃條件下孵育4 h，去除原培養基，在每孔中加入二甲基亞砜(150 μl)，用酶標儀檢測細胞活力。

1.11 流式細胞檢測實驗

將細胞接種于96孔板，當細胞融合度達80%時進行如1.9中的細胞干預。加入磷酸鹽緩沖液，調整細胞濃度至1×105個·ml-1。 混合后取1 ml細胞懸液，100 r·min-1離心10 min后棄上清，加入碘化丙啶和膜聯蛋白Ⅴ-FITC各5 μl，充分混合，室溫避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.12 統計學處理

采用SPSS 19.0進行統計學分析，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-30e激動劑或拮抗劑對IR損傷大鼠神經功能和腦梗死的影響

假手術組大鼠無神經功能障礙及腦梗死；其余6組神經功能評分明梗死體積的比較差異有統計學意義(分別F=65.321和F=52.109，均P<0.001)；與激動劑對照組比較，miR-30e激動組神經功能評分明顯較低、梗死體積明顯較小(均P<0.05)；與拮抗劑對照組比較，miR-30e拮抗劑組神經功能評分明顯較高、梗死體積明顯較大(均P<0.05)。見圖1。

a 與假手術組比較，P<0.05；b 與激動劑對照組比較，P<0.05；c 與拮抗劑對照組比較，P<0.05

2.2 miR-30e激動劑或拮抗劑對IR損傷大鼠5-LOX的影響

7組miR-30e相對表達量和 5-LOX蛋白表達量的比較差異均有統計學意義(分別F=44.240和F=29.002，均P<0.001)；與假手術組比較，模型組大鼠皮質梗死周圍區組織miR-30e和5-LOX表達水平明顯升高(均P<0.05)；與激動劑對照組比較，miR-30e激動組miR-30e和5-LOX表達水平明顯下降(均P<0.05)；與拮抗劑對照組比較，miR-30e拮抗劑組miR-30e和5-LOX表達水平明顯升高(均P<0.05)。見圖2。

a 與假手術組比較，P<0.05；b 與激動劑對照組比較，P<0.05；c 與拮抗劑對照組比較，P<0.05

2.3 miR-30e激動劑或拮抗劑對IR損傷大鼠炎癥因子的影響

7組CysLT和LTB4 表達水平的比較差異均有統計學意義(分別F=23.931和F=30.002，均P<0.001)；與假手術組比較，模型組大鼠皮質梗死周圍區組織CysLT和LTB4表達水平明顯升高(均P<0.05)；與激動劑對照組比較，miR-30e激動組CysLT和LTB4表達水平明顯下降(均P<0.05)；與拮抗劑對照組比較，miR-30e拮抗劑組CysLT和LTB4表達水平明顯升高(均P<0.05)。見圖3。

a 與假手術組比較，P<0.05；b 與激動劑對照組比較，P<0.05；c 與拮抗劑對照組比較，P<0.05

2.4 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-30e對5-LOX的靶向作用關系

用TargetScan在線工具預測到5-LOX是miR-30e的候選靶基因。7組腎素/螢火蟲熒光素酶活性比值的比較差異有統計學意義(F=11.234，P=0.001)。與5-LOX-Wt+NC組比較，5-LOX-Wt+mimic組的腎素/螢火蟲熒光素酶活性比值明顯降低(P<0.05)，5-LOX-Wt+inhibitor組明顯升高(P<0.05)。當miR-30e結合位點發生突變時，5-LOX-Mut+mimic組和5-LOX-Mut+inhibitor組的腎素/螢火蟲熒光素酶活性比值均保持在較高水平，見圖4。以上結果說明，5-LOX是miR-30e的靶基因。

a 與5-LOX-Wt+NC組比較，P<0.05

2.5 miR-30e 模擬物或抑制劑對OGDR損傷細胞5-LOX的影響

6組miR-30e相對表達量和5-LOX蛋白表達水平比較差異均有統計學意義(分別F=11.134和F=9.201，均P<0.01)；與常氧組比較，OGDR組miR-30e和5-LOX表達水平明顯升高(均P<0.05)；與mim-miR-NC組比較，mim-miR-30e組miR-30e和5-LOX表達水平明顯降低(均P<0.05)；與inh-miR-NC組比較，inh-miR-30e組miR-30e和5-LOX表達水平明顯升高(均P<0.05)。見圖5。

a 與常氧組比較，P<0.05；b 與mim-miR-NC組比較，P<0.05；c 與inh-miR-NC組比較，P<0.05

2.6 miR-30e模擬物或抑制劑對OGDR損傷細胞的活力和凋亡的影響

8組細胞增殖活力和細胞凋亡率的比較差異均有統計學意義(分別F=10.012和F=15.003，均P<0.001)；與常氧組比較，OGDR組細胞活力明顯下降，而凋亡明顯增加(均P<0.05)；與mim-miR-NC組比較，mim-miR-30e組和mim-miR-30e+si-5-LOX組細胞活力明顯升高，而凋亡明顯減少(均P<0.05)；與inh-miR-NC組比較，inh-miR-30e組細胞活力明顯下降，而凋亡明顯增加，inh-miR-30e+si-5-LOX組細胞活力明顯升高，而凋亡明顯減少(均P<0.05)。見圖6。

a 與常氧組比較，P<0.05；b 與mim-miR-NC組比較，P<0.05；c 與inh-miR-NC組比較，P<0.05

3 討 論

越來越多的研究證實，miRNA在IR損傷中發揮重要作用[11]。miR-30e是miR-30家族的重要成員之一，與細胞增殖、分化、凋亡、自噬和細胞周期等有關，可參與癌癥[12]、糖尿病[13]和心臟病[14]等疾病的發生和發展。本研究發現，miR-30e在大鼠腦IR損傷后皮質梗死周圍區中顯著升高，并且可能與神經炎癥有關。神經炎癥時腦IR損傷后常見的病理變化與神經功能缺損密切相關[15]。

miR-30e在炎癥損傷中的作用機制尚未明確，可能通過NLRP3 炎癥小體[2]、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子信號通路[16]和Notch信號通路[17]等發揮作用。本研究采用生物信息學和雙熒光素酶報告基因實驗證實5-LOX是miR-30e的靶基因。5-LOX是白三烯生物合成的關鍵酶，與中樞神經系統炎癥性疾病有關[5]。本研究中，腦IR損傷后5-LOX、CysLT和LTB4表達水平明顯升高，miR-30e 激動劑明顯降低了其表達，而miR-30e 拮抗劑又可以上調其表達，說明miR-30e在腦IR損傷中起到抗炎作用。本研究結果顯示，miR-30e 激動劑可減輕腦IR損傷誘發的神經損傷，并縮小梗死面積，而miR-30e 拮抗劑可加重神經損傷，說明miR-30e有神經保護作用，本研究體外研究也予以證實。體外研究顯示，miR-30e可以促進神經細胞活性并抑制細胞凋亡。

為了進一步證實miR-30e與5-LOX的關系，我們用siRNA下調PC12細胞中5-LOX的表達。研究發現，siRNA可以緩解miR-30e抑制劑對細胞的損傷，而miR-30e模擬物可以抵消這種作用。miR-30e抑制劑可以抵消miR-30e對5-LOX的抑制作用，加重細胞損傷。然而當用miR-30e 模擬物處理細胞時，雖然5-LOX表達明顯下調，但是5-LOX-siRNA并不能降低5-LOX表達，說明5-LOX-siRNA并不能緩解miR-30e模擬物導致的PC12細胞損傷。以上結果說明，5-LOX是miR-30e下游的重要分子。

綜上所述，miR-30e對大鼠腦IR損傷和OGDR細胞損傷具有神經保護作用，這種作用可能通過5-LOX進行介導。miR-30e可能是治療腦IR損傷的潛在靶點。