外傷脫位牙保存介質及溫度對人牙周膜細胞活性和增殖能力的影響

聶述琳，朱鋒 ,孟翔峰，聶蓉蓉

[南京大學醫學院附屬口腔醫院(南京市口腔醫院) 1.修復科，2. 頜面外科，江蘇 南京 210008]

外傷脫位牙是指牙齒因為外傷從牙槽骨中完全脫出，是最嚴重的牙病之一。牙脫位造成神經血管供應受損，人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts, hPDLFs)喪失和牙髓壞死[1]。即刻牙再植被認為是一種有效的治療外傷脫位牙的方法，但這往往難以做到，牙再植術成功的關鍵是術前最大限度保存牙根表面hPDLFs活力。如果牙根表面hPDLFs數量較少，再植后則會導致牙周膜愈合不良，發生骨性粘連或牙根外吸收。因此學者們建議，如果不能立即行脫位牙再植術，則應將撕脫的牙齒保存在適當的培養基中以保持生存能力，特別是細胞增殖能力[2-3]。

本研究旨在通過體外細胞培養模擬牙脫位保存模型，研究不同保存介質和保存溫度對hPDLFs活性和增殖能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和鑒定

本研究經南京大學醫學院附屬口腔醫院倫理委員會審核通過，編號2014NL-025(KS)。

選擇南京大學醫學院附屬口腔醫院頜面外科門診因正畸需拔除的青少年的健康雙尖牙進行牙周膜細胞原代培養。細胞培養采用DMEM培養液，含10%胎牛血清(Gibco)、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺、100 IU·ml-1青霉素和100 μg·ml-1鏈霉素(Invitrogen)。培養瓶置于37 ℃恒溫孵箱中靜置培養，培養條件為5%CO2、100%濕度。

細胞培養至第4代進行角蛋白和波形絲蛋白染色鑒定，0.3% Triton X-100 (Sigma)對細胞作用5 min后用5%牛血清白蛋白(Sigma)封閉1 h。樣品洗滌后，在37 ℃下用熒光標記的二抗(Invitrogen)孵育1 h，細胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) (Sigma)染色。圖像由共聚焦熒光顯微鏡(Olympus)拍攝。

1.2 實驗方法

將第5代細胞消化后調整細胞密度為1×105個·ml-1，96孔板(Thermo Fisher Scientific)每孔接種100 μl 細胞懸液，37 ℃、5%CO2培養。待細胞生長融合到80%左右時去除原培養基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗兩遍后分別加入PBS、全脂牛奶(光明)、唾液和純凈水4種保存介質，每組100 μl，其中加入PBS的為對照組，其余3種為實驗組。唾液采用0.22 μm除菌過濾器過濾滅菌。選擇兩個實驗條件(4 ℃和室溫)，放置1 h，然后去除對照組及實驗組細胞培養液，PBS漂洗兩遍。

1.2.1 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷 (5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)實驗 漂洗后每孔加入含10 μmol·L-1EdU的DMEM培養基, 繼續培養4 h后收集細胞；多聚甲醛固定后加入含Alexa FluorTM488熒光染料的EdU反應液，室溫孵育30 min；PBS漂洗細胞后采用DAPI染料染色細胞核，甘油封片后采用激光共聚焦顯微鏡觀察具有綠色熒光的細胞密度。

1.2.2 細胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)實驗 漂洗后每孔重新加入DMEM培養基100 μl，孵育24 h后棄除原培養基，PBS漂洗3遍后分別加入含10%CCK-8(Dojindo Laboratories)的DMEM培養基100 μl，放置培養箱中保存2 h后，使用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其光吸收值(OD值)，對細胞活力進行檢測。同時為了分析不同保存介質對hPDLFs生長狀態的影響，我們按照上述方法連續檢測24、48和72 h的OD值，觀察細胞生長曲線。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件包對實驗數據進行統計分析，相同溫度下不同保存介質之間采用Kruskal-Wallis檢驗，同種保存介質不同溫度條件之間采用Mann-Whitney檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 人牙周膜細胞鑒定

對分離純化后的第4代細胞進行免疫熒光鑒定結果(圖1)顯示：該細胞表達波形蛋白(圖1C)，不表達角蛋白(圖1B)，符合hPDLFs特征。

圖1 人牙周膜細胞的鑒定

2.2 EdU實驗

EdU實驗顯示：在相同的保存溫度下，牛奶處理hPDLFs 1 h后，EdU陽性細胞(綠色)約占總細胞的50.9%(4 ℃)和41%(室溫)，表達差異具有統計學意義(P=0.007)；采用唾液處理hPDLFs 1 h后，EdU陽性細胞(綠色)約占總細胞的36.56%(4 ℃)和27.33%(室溫)，表達差異具有統計學意義(P=0.008)；當采用純凈水處理細胞后，細胞大量死亡，存活數量極少(圖2)。當選擇相同的保存介質時，細胞保存在4 ℃環境下EdU陽性細胞明顯多于室溫保存的細胞。上述結果提示，細胞保存于牛奶和低溫環境中更有利于維持其增殖活性。

a、b、c、d相同字母間比較，P>0.05；不同字母間比較，P<0.05

2.3 細胞活力檢測

為了明確不同保存介質和溫度對hPDLFs 細胞活力的影響，采用CCK-8檢測發現，不同的保存介質干預hPDLFs 1 h后，以PBS 4 ℃為對照組基數(100%)，4 ℃下牛奶、唾液、純凈水中hPDLFs活力依次約為62.8%、17.8%、3.3%，室溫下則依次為56.2%、15.2%、0.7%(圖3)，不同處理組間CCK-8檢測OD值差異均具有統計學意義(P<0.05)。上述結果提示，細胞保存于牛奶和低溫環境中更有利于維持其活力。

a、b、c、d相同字母間比較，P>0.05；不同字母間比較，P<0.05

2.4 細胞生長曲線

為了進一步探討不同保存介質對細胞生長的影響，hPDLFs經過不同保存介質和溫度預處理1 h后更換完全培養基，于培養箱中繼續培養24、48、72 h。CCK-8檢測顯示，細胞保存于4 ℃牛奶中的生長曲線最接近于正常對照，而保存于唾液和純凈水中的細胞生長緩慢，與牛奶保存相比，細胞增殖速率差異具有統計學意義。在室溫條件保存，細胞雖然在48 h表現出與4 ℃組類似的增殖活性，但是在72 h 時，牛奶組的增殖活性低于4 ℃組，唾液和純凈水則出現了增殖遲緩甚至減少的趨勢(圖4)。上述結果表明，細胞保存于牛奶和低溫環境中更有利于維持其原有的生長狀態。

a、b、c、d相同字母間比較，P>0.05；不同字母間比較，P<0.05

3 討 論

3.1 暴露時間和實驗方法的選擇

如何為外傷脫位牙找到最合適的存儲介質，是口腔創傷醫學面臨的挑戰。在以往的研究中，各種類型的存儲介質在體外維持hPDLFs生存能力的有效性，主要是將存儲介質作為培養基作用在培養的hPDLFs上進行測試，或將提取的牙齒直接浸入測試介質中，然后對活細胞進行定量[4-5]。本研究選擇的是前者，也就是在細胞培養的基礎上使用不同的存儲液，主要是考慮充足的細胞量能夠保證實驗條件的一致性。本研究選取的暴露時間也就是脫位牙需要使用存儲介質的時間是1 h，因為一般情況下，牙齒脫位后患者基本能在1 h左右趕往醫院急診進行再植手術，所以我們的研究方案是將牙根表面牙周膜細胞先在儲存介質中保存1 h，然后檢測更換為正常培養基后24、48、72 h細胞的活力和增殖能力，以此模擬脫位牙再植后牙根表面牙周膜細胞的一個生存狀態。

3.2 保存介質的影響

已經有很多研究就牛奶、橄欖油、蜂膠、椰子水、Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)及多種培養基作為脫位牙保存介質，對hPDLF增殖活力的影響進行過研究，盡管多數認為HBSS是一種最適合用作外傷脫位牙保存的媒介，但在日常生活中難以即刻獲得[6]。本研究主要從保存液獲取的難易程度上考慮，選擇了民眾最容易立即得到的牛奶、唾液、純凈水3種保存液。從研究結果我們看到，以牛奶作為培養介質的hPDLFs，細胞活性最好，48和72 h細胞持續增長。本研究結果也符合美國牙髓病學協會建議將牛奶作為脫位牙保存介質的指導意見。

牛奶作為儲存介質的有效性可能是其具有適宜的生理pH值和滲透壓，同時牛奶里含有一些營養成分和生長因子如表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)、 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)，這些都能促使細胞更好地增殖[7]。唾液是一種生理保存液，尤其是在牙外傷時，因環境條件等限制，它可認為是保存脫位牙方便而快捷的介質。因為唾液的滲透壓較低且存有細菌，所以進行牙再植術前，應用生理鹽水將脫位牙根面因外傷所致的細胞溶解物、殘渣和唾液中的細菌洗凈，以保證再植牙的成功[8]。純凈水是一種易于獲得的保存介質，但是由于純凈水的pH值、低滲透壓可以導致細胞裂解，它在一定程度上可以作為陰性對照[9-10]。

3.3 溫度的影響

溫度對貯藏溶液維持細胞增殖能力的影響也需要進一步研究。系統性評價發現，大部分的實驗結果中，4 ℃時hPDLFs的活力比20 ℃時更高，這些保存介質包括了牛奶、椰汁、蜂膠、蛋清、水；但HBSS卻相反，研究結果顯示，20 ℃保存條件下hPDLFs的活力更好[5]。也有研究認為，只要hPDLFs儲存在合適的培養基如HBSS、DMEM或牛奶中，溫度起的作用很小[11-12]。然而本研究的結果與Sigalas等[13]的發現相同，細胞在4 ℃ 的低溫作用下，雖然對后期增殖能力有所影響，但48、72 h后其增殖能力是逐漸恢復的。所以我們認為低溫介質更適合于保護hPDLFs的增殖能力。

雖然本研究結果認為低溫牛奶是保存外傷脫位牙最為方便有效的保存介質，但值得注意的是實驗室研究和真正臨床病例的差異性，我們還需要結合更多的其他細胞代謝測定方法，才能得出最終的結論。