一個復合雜合突變導致的遺傳性凝血因子XII缺陷癥家系分析

李少禧，李小龍，金艷慧，楊麗紅，張海月，王明山

（溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

人類凝血因子XII（FXII）是由肝臟合成的一種絲氨酸蛋白酶原，成熟的蛋白質由596個氨基酸殘基所組成，在外周血血漿中的濃度為30～35 μg/mL， 半衰期為50～70 h[1]。FXII在內源性凝血途徑啟動中起著重要的作用，先天性FXII缺陷癥是一種常染色體隱性遺傳病。根據FXII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原（FXII:Ag）在血漿中的水平不同，分為3種類型：I型是交叉反應物質陰性型（CRM-），即抗原檢測不到；II型為交叉反應物質陽性型（CRM+），即抗原水平正常；III型為交叉反應物質降低型（CRMRed），即抗原水平降低。有研究表明[2-4]，FXII缺陷通常不會發生自發性出血癥狀，反而是血栓形成的一個危險因素。本研究對一個復合雜合F12 基因突變導致的遺傳性FXII缺陷癥家系進行表型與基因檢測，并采用生物信息學相關軟件對其基因突變的位點進行分析，初步探討其分子致病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，男，50歲，浙江平陽人，因創傷性右肱骨骨折入院，平常無異常出血史或血栓形成史。常規的術前檢查發現活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）為59.1 s，明顯延長（參考范圍為29.0～43.0 s），進一步的凝血因子檢測顯示FXII:C下降，只有4%，FXII:Ag下降，只有5%（參考范圍為72%～130%）。其他實驗指標如凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）等均在正常參考范圍，纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）偏高，為4.44 g/L（參考范圍為2～4 g/L），初步診斷為FXII缺陷癥。在得到先證者和家系成員知情同意的前提下，采取了其他4位家系成員的外周血以分析FXII缺乏的原因。家系譜見圖1。同時，選擇100名本院健康體檢者作為健康對照組，男57名，女43名，年齡22～60歲，無肝腎功能異常，無異常出血史和血栓史，且采樣已征得本人同意。本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院倫理學委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理：采集受檢者外周靜脈血2.7 mL，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9 抗凝， 3 000 r/min離心10 min，上層乏血小板血漿用于凝血指標檢測，并于2 h內完成，下層血細胞用于提取基因組DNA，并進行PCR擴增及測序。

圖1 遺傳性FXII缺陷癥家系圖

1.2.2 血漿凝血指標檢測：PT、APTT、凝血因子VIII促凝活性（FVIII：C）、凝血因子IX促凝活性（FIX：C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）和FXII:C等凝血指標采用一期凝固法在法國Stago STA-R全自動血凝儀上測定（配套試劑由法國Stago公司提供）；FXII:Ag采用ELISA法測定。所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.3 DNA提取及PCR擴增：采用酚-氯仿法抽提受檢者的外周血基因組DNA，參照文獻[5]設計合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。PCR擴增：反應體積共50 μL，包括Taq PCR Mastermix 25 μL，ddH2O 18 μL，DNA模板3 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL。反應條件：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變形30 s，根據不同引物分別以相應退火溫度（60～64 ℃）退火30 s，72 ℃延伸45 s （共35個循環），72 ℃延伸10 min。

1.2.4 DNA序列分析：PCR擴增產物純化后送上海桑尼生物工程有限公司直接測序，所用測序儀為ABI PRISM 3730。測序結果用Chromas軟件與美國NCBI基因庫所公布的F12 基因序列（Genbank AF538691） 進行比對，尋找基因突變位點。發現基因突變的序列則反向測序予以證實，再擴增其他家系成員相應外顯子片段。對100名健康對照組人群相應的區域進行PCR擴增、測序，用于排除基因多態性。

1.2.5 保守性分析和生物信息學預測：采用多序列比對軟件ClustalX-2.1-win將突變氨基酸與其他7種同源物種（家鼠、褐家鼠、泛穴居人、獼猴、犬狼瘡屬、金絲猴、刺葉黃耆）的氨基酸序列進行比對，分析突變氨基酸在物種進化過程中的保守性。并用4個在線生物信息學軟件（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）預測氨基酸替換是否會影響FXII蛋白的功能和結構。

1.2.6 突變蛋白空間結構模型分析：以蛋白數據庫（PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home/do.PDB，ID：4XDE）中的3D結構為基礎，用Swiss-PDB Viewer 4.0.1軟件和蛋白質相互作用計算器程序（http://pic.mbu.iisc.ernet.in）生成蛋白質模型，分析F12 基因突變前后由氨基酸變化引起蛋白質空間結構的改變。

2 結果

2.1 凝血指標檢測結果 先證者APTT為59.1s（參考范圍29.0～43.0 s），明顯延長，FXII:C降低至4%，FXII:Ag降低至5%；其父親、母親和女兒APTT均為正常，FXII:C和FXII:Ag降低至32%～37%，其妻子各指標均正常，見表1。先證者及家系其他成員PT、FVIII:C、FIX:C和FXI:C也均在參考范圍內（未列出）。

表1 家系成員實驗室表型和基因型分析結果

2.2 DNA序列分析結果 除常見的46C/T多態性（先證者和其父親為46C/T雜合型，其余3個家系成員均為46C/C野生型）外，先證者F12 基因第13號外顯子存在復合雜合基因突變，即c.1561G＞A雜合錯義突變（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C雜合錯義突變（p.Met527Thr）；其父親為p.Met527Thr攜帶者，母親和女兒為p.Glu502Lys攜帶者（見表1和圖2）。基因檢測結果與凝血指數檢測結果相應。對100例健康對照者F12 基因13外顯子進行測序，均未發現c.1637T＞C，排除基因多態性。查閱國內外文獻及相關網站，c.1637T＞C突變位點未見報道。

2.3 生物信息學分析 同源序列比對分析顯示在現代智人和其他7 種同源物種（家鼠、褐家鼠、泛穴居人、獼猴、犬狼瘡屬、金絲猴、刺葉黃耆）里Glu502和Met527是個高度保守的序列（見圖3）。根據4個生物信息學軟件對p.Glu502Lys突變的預測結果為“致病的”“良性的”“有害的”和“影響蛋白功能”；而對p.Met527Thr突變的預示為“致病的” “可能危害性”“有害的”和“影響蛋白功能的”（見 表2）。蛋白模型3D分析的結果顯示Glu502 替換為Lys502 導致Glu502-His365 之間氫鍵的消失；Met527替換為Thr527導致Thr527-Leu524之間增加2條氫鍵（見圖4）。

圖2 F12 基因第13號外顯子測序結果

圖3 保守性分析圖表（箭頭所指為目標氨基酸）

3 討論

本家系的研究結果顯示，先證者F12基因的第13號外顯子上存在復合雜合基因突變，即p.Glu502Lys 雜合錯義突變和p.Met527Thr雜合錯義突變，其FXII:C和FXII:Ag均極度降低；其父親為p.Met527Thr攜帶者，母親和女兒為p.Glu502Lys攜帶者，FXII:C和FXII:Ag均有不同程度降低。其妻子F12 的基因型為Glu502和Met527野生型，FXII:C和FXII:Ag均為正常。同時，先證者和其父親F12 基因1號外顯子上46位為46C/T基因型，其余家系三成員均為46C/C基因型，這也表明46C/T這個基因多態性并不引起這個家系FXII活性和抗原性的下降。此外，沒有其他因素導致FXII活性和抗原的下降，且在復合雜合FXII缺陷里FXII:C及FXII:Ag降低的程度也和許多報道一致[6-7]。由此推斷p.Glu502Lys和p.Met527Thr這種復合雜合突變導致了FXII活性和抗原的降低。

遺傳性FXII缺陷癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病。FXII嚴重缺乏的個體常常表現為體外實驗APTT延長而體內并無出血傾向[8]。有研究結果表明[3]，復合雜合子突變的FXII活性和抗原水平比單個雜合子的更低，且幾乎所有的復合雜合突變和純合突變有一樣的表型特征，即FXII活性和抗原水平極低。該先證者的FXII活性和抗原水平同步顯著下降，為III型FXII缺陷癥（CRM-），提示這個突變蛋白的合成、分泌和功能受到了損害[9]。通過家系圖，可以看出該先證者的復合雜合突變p.Glu502Lys和p.Met527Thr遺傳自其父親和母親，這種遺傳模式與其他遺傳性FXII缺陷癥患者的常染色體隱性遺傳模式相符。p.Met527Thr突變為國際上首次報道，而p.Glu502Lys已經有過報道[6-7]。

為了進一步探討p.Glu502Lys和p.Met527Thr突變對FXII水平的影響，本研究分析了這些位點保守性和突變對蛋白的可能影響。保守性分析結果表明，Glu502和Met527在同源物種間高度保守，表明這些位點在FXII常規功能中發揮了關鍵的作用。信息生物學的結果顯示p.Glu502Lys和p.Met527Thr突變很可能是有害突變，會影響FXII的結構和功能，從而導致疾病的發生。

表2 生物信息學軟件分析結果

圖4 模型分析圖

Glu502和Met527位于FXII蛋白輕鏈催化域（催化三聯體His393-Asp442-Ser544)，其中Met527靠近有活性的Ser544。進一步研究表明FXII蛋白的催化域在372～614的氨基酸殘基區，在蛋白的酶活性功能中是個關鍵部位。為了分析突變對蛋白空間結構的影響，本研究運用了模型分析，結果顯示Glu502替換為Lys502導致了Glu502-His365之間氫鍵消失；Met527替換為Thr527導致了Thr527-Leu524之間增加2條氫鍵。氫鍵的聯接對維持蛋白空間構象和穩定有著重要作用，因此，這些改變可能影響了催化域微妙的空間結構從而導致FXII蛋白的激活及活性。對Glu502Lys的體外實驗表達研究發現，突變蛋白在細胞的前高爾基體里被廣泛降解，從而導致了突變蛋白的低水平表達[7]。通過對突變FXII蛋白（p.Gly531Glu）的功能研究發現，該突變導致FXII對激肽釋放酶原的裂解活性存在局部缺陷[3]。由于Met527位點靠近Gly531，我們推測p.Met527Thr突變蛋白與p.Gly531Glu一樣存在功能缺陷。

綜上所述，本研究在一個遺傳性FXII缺陷癥患者身上發現了兩種錯義突變（p.Glu502Lys和p.Met527Thr），這些突變可能導致了催化域空間結構的改變，從而降低了FXII的活性和抗原水平，但其確切分子致病機制有待進一步研究。