Ghrelin對大鼠胃排空及食管下括約肌壓力的影響及其機制

曹曙光，吳昊，林李淼

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 消化內科，浙江 溫州 325027）

胃促生長素（Ghrelin）是一個新發現的由28個氨基酸組成的內源性肽，它是生長激素促分泌物質受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的內源性配體，與GHSR結合后可產生廣泛的生物學效應。在具有促生長激素（growth hormone， GH）分泌作用的同時，又具有增強食欲，減少脂肪利用，增加體質量[1]，維持能量正平衡和調節能量代謝的作用[2]，同時與調節胃排空的激素胃動素（Motilin）在結構上具有高度相同性[3]，故其與胃腸道運動的關系已引起人們的關注。本研究旨在觀察不同劑量Ghrelin腹腔注射后大鼠胃排空效應，觀察Ghrelin對食管下括約肌（lower esophageal sphincter，LES）壓力的影響，同時測定血漿中Motilin和P物質（Substance P）水平的變化，探討Ghrelin對LES壓力的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，體質量200～250 g，動物生產許可證號：SCXK（浙）2015-0001；大鼠Ghrelin購自美國Sigma公司；Motilin和Substance P放免試劑盒由北京?？其J生物技術中心提供；UPS-2020型低順應性毛細管連續水灌注測壓系統（荷蘭MMS公司）；三腔微細通道測壓管（美國Sandhill公司），外徑1.7 mm，內徑0.4 mm，各側孔之間距離均為2.0 mm， 水流的速度為每側孔0.2 mL/min。

1.2 方法

1.2.1 動物和分組：Wistar大鼠60只，置于（22± 3）℃室溫下，安靜環境飼養，晝夜循環光照，自由飲水、取食，大鼠適應性飼養1周后，禁食24 h、禁水12 h，采用完全隨機分組方法將大鼠分為對照組和實驗組，其中實驗組又分為5組，每組10只。另取Wistar大鼠30只，采用完全隨機分組方法將大鼠分為實驗組和對照組，每組15只，實驗組大鼠腹腔注射Ghrelin 1.5 nmol/kg，對照組大鼠每天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL，60 min后，所有大鼠進行LES壓力測定，尾靜脈取血，用放射免疫法測定血漿中Motilin和Substance P濃度，比較2組間LES壓力和血漿中Motilin和Substance P濃度差異。

1.2.2 半固體糊制備：取5 g羥甲基纖維素溶于125 mL蒸餾水中，然后分別加入8 g奶粉，4 g糖， 4 g淀粉，每次加入攪拌均勻，配成150 mL約150 g的半固體糊[4]，置于冰箱冷藏12 h，使用前2 h取出恢復至室溫。

1.2.3 大鼠胃排空測定：5組實驗組大鼠，每組10只，分別接受不同劑量的Ghrelin（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 nmol/kg）腹腔注射，對照組大鼠接受0.9%氯化鈉溶液1 mL腹腔注射，45 min后所有大鼠半固體糊1.0 mL/只灌胃，灌胃后30 min尾靜脈取血并處死動物，打開腹腔，結扎幽門和賁門，取出胃，用濾紙擦干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內容物后擦干，稱凈重。以胃全重和胃凈重之差為胃內殘留物質量，計算胃內殘留物占所灌半固體糊質量百分比為胃內殘留率，按下式計算胃排空率，胃排空率=[1-（胃全重-胃凈重）]×100%。

1.2.4 大鼠血漿Motilin和Substance P測定：所有大鼠尾靜脈取血放入含EDTA二鈉0.3 μL和抑肽酶1 000 kU的試管中，試管中血液標本經混勻，低溫離心10 min（3 000 r/min），分離血漿，用放射免疫法測定血漿中Motilin和Substance P濃度。

1.2.5 LES壓力測定：食管測壓采用定點牽拉法（stationary pull-through technique，SPT）確定LES位置，固定測壓管，應用低順應性毛細灌注測壓系統監測大鼠LES壓力。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS11.5統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組間大鼠胃排空比較 對照組大鼠胃排空率為（27.03±2.91）%，而腹腔注射不同劑量Ghrelin的實驗組大鼠胃排空率為（38.24±7.15）%，明顯大于對照組，2組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 Ghrelin對大鼠胃排空的量效關系 健康雄性Wistar大鼠小劑量Ghrelin（0.5 nmol/kg）腹腔注射后的胃排空率為（29.78±4.68）%，對照組為（27.03±2.91）%，2 組間差異無統計學意義（P ＞0.05），中等劑量及高劑量Ghrelin（1.0、1.5、2.0、2.5 nmol/kg）腹腔注射后胃排空率逐漸增加，分別 為（34.59±4.07）%、 （38.33±4.41）%、 （41.88± 3.94）%、 （46.64±4.14）%，與對照組比較均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 2 組大鼠LES壓力及血漿中Motilin和Substance P濃度比較 實驗組大鼠LES壓力明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗組大鼠血漿中Motilin濃度高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗組大鼠血漿中Substance P與 對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1， 提示Ghrelin能增加大鼠LES壓力。Motilin可能參與Ghrelin對大鼠LES壓力的調節。

表1 2組間大鼠LES壓力及血漿中Motilin和Substance P濃度比較（每組n=15，）

表1 2組間大鼠LES壓力及血漿中Motilin和Substance P濃度比較（每組n=15，）

與對照組比：aP＜0.01

分組 LES壓力（mmHg）Substance P（ng/L）對照組 13.78±2.29 190.02±18.18 21.18±5.43實驗組 19.57±3.26a 217.28±25.38a 24.36±5.55 Motilin（ng/L）

3 討論

Ghrelin是一個新發現的由28個氨基酸組成的內源性肽，具有增強食欲，減少脂肪利用，增加體質量，維持能量正平衡的調節能量代謝的作用；同時與調節消化道運動的激素Motilin在結構上具有高度相似性，一些研究已表明Ghrelin有促消化道動力作用[5]。近來動物實驗表明，Ghrelin及其激動劑作用于嚙齒類動物后能加速胃排空[6]，對術后梗阻的大鼠模型的胃排空也有促進作用[7]，在對人的研究中亦發現，Ghrelin能加速正常人胃排空效 應[8-9]，同樣對特發性胃輕癱和糖尿病胃輕癱患者有促胃排空作用[10]；同時，Ghrelin也能促進小腸及結腸推進運動作用[11-12]。

本研究結果顯示，Ghrelin能加速大鼠胃排空，存在一定的量效關系。小劑量Ghrelin腹腔注射后，胃排空較對照組有增加，但差異無統計學意義，中、大劑量Ghrelin腹腔注射后胃排空率呈逐漸增加趨勢。內源性Ghrelin能調節大鼠及小鼠胃出現III相樣收縮[13]，誘發胃和十二指腸移行性運動復合波III相提前出現，同時能加強移行性運動復合波III相收縮強度。Ghrelin激動劑TZP-101 能明顯緩解胃癱患者的惡心和嘔吐癥狀[14]。健康大鼠口服或腹腔注射左旋多巴后，胃排空效應明顯受抑制，但Ghrelin能明顯逆轉左旋多巴對大鼠的胃排空抑制作用[15-16]，本研究與上述研究結果相一致，提示Ghrelin能加速胃排空。

胃食管反流病是消化科常見病，是指胃十二指腸內容物反流入食管引起食管黏膜損害，出現燒心和胸骨后不適等癥狀。主要發病機制與LES松弛、食管廓清能力下降及反流物對食管黏膜攻擊作用增強有關。大量臨床研究已證實胃排空障礙患者胃酸及胃內容物向食管反流明顯增多，可導致胃食管反流病發病率增加及反流癥狀的加重[17]，促胃動力藥物5-羥色胺4受體激動劑能明顯改善胃食管反流病患者的癥狀[18]。有研究表明肥胖者胃食管反流病發病率較非肥胖者有升高，其可能機制與肥胖者食管酸暴露時間增加及LES壓力下降有關[19-20]。有學者研究發現，Ghrelin能增加Barrett’s食管風險[21]，Ghrelin可增強食欲，減少脂肪利用，以增加體質量，增加胃食管反流病發生的風險；同時Ghrelin有促進胃排空，減少胃酸或胃十二指腸內容物的反流。目前有關Ghrelin與胃食管反流病的關系國內外研究較少。

LES松弛是胃食管反流病的主要發病機制，LES的神經支配主要來自迷走神經，迷走神經由興奮性膽堿能和抑制性非腎上腺能非膽堿能神經元組成，形成突觸分布介導LES壓力的增加和減低，LES壓力是興奮性和抑制性兩種因素的平衡決定的，此外尚有體液因素參與LES壓力的調節，本實驗研究結果提示，Ghrelin腹腔注射能增加LES壓力，腹腔注射Ghrelin后，血漿Motilin濃度較對照組升高，而Substance P 2組間差異無統計學意義，說明Motilin可能參與Ghrelin對大鼠LES壓力的調節。Motilin作用于平滑肌上的Motilin受體，導致平滑肌收縮，增加LES壓力；Substance P直接刺激膽堿能神經元和作為非膽堿能興奮性神經遞質作用于LES，使LES壓力增加。Ghrelin作為新發現的胃腸激素，是否參與LES壓力的調節，國內尚無研究。

本研究結果表明，Ghrelin具有加強胃體收縮，促進胃排空，且呈一定的量效關系，Ghrelin能增加LES壓力，Motilin可能參與Ghrelin對LES壓力的調節，但Ghrelin對胃排空及LES壓力影響的病理生理學機制尚待深入研究揭示。