腦缺血再灌注不同時間對大鼠海馬神經元自噬及PI3K/mTOR通路的影響

邵錦根，楊江，陳浩浩，陶紅苗，李旭升

（1.金華市人民醫院 神經內科，浙江 金華 321000；2.金華職業技術學院 醫學院，浙江 金華 321017）

缺血性腦卒中已成為嚴重危害我國居民生命健康的主要疾病之一[1]。研究發現，自噬是溶酶體介導的對體內受損細胞器及大分子物質進行降解的過程，自噬被過度激活后會導致細胞程序性死亡，與腦卒中的病理機制關系密切[2-3]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路在自噬中發揮重要的調節作用[4]。海馬是大腦中對缺血缺氧損傷極敏感的區域[5]。本研究用四血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，探討腦缺血再灌注不同時間對大鼠海馬神經元自噬及PI3K/mTOR通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠72只，體質量180～250 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0005，動物合格證號0267780。

1.1.2 實驗試劑和儀器：栓線2634-A4型（北京沙東生物有限公司）；兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體（英國Abcam公司）；兔抗大鼠LC3 II多克隆抗體（英國Abcam公司）；p-PI3K、p-Akt及p-mTOR抗體（美國Santa Cruz公司）；FITC標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋科技有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；PVDF膜0.45 μm（美國Santa Cruz公司）；ECL化學發光試劑盒（美國Pierce Biotechnology公司）；Nikon攝影生物光學顯微鏡（日本Nikon公司）；Tecnai G2 Spirit Bio TWIN透射電鏡（美國FEI公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備：參照文獻[6]采用四血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為假手術組和缺血再灌注組。缺血再灌注組：夾閉雙頸總動脈缺血 15 min[7]，分別恢復血流灌注0、6、12、24、36 h；假手術組：除不夾閉雙側頸總動脈外其他處理同缺血再灌注組。每組12只。缺血再灌注后從每組中隨機選取5只對神經功能缺損進行評分，剩余大鼠立即斷頭取海馬組織-80 ℃保存備用。

1.2.2 神經功能缺損評分：大鼠缺血再灌注不同時間后，從每組中隨機選取5只，參考文獻[8]對大鼠神經功能缺損進行評分。

1.2.3 缺血再灌注對大鼠腦梗死面積影響：參照文獻[9]采用TTC染色法用于測量腦梗死面積。采用 ImageJ 1.45圖像分析軟件測量每張染色圖片的梗死面積，梗死腦組織百分比=梗死區面積/（梗死面積+非梗死面積）×100%。

1.2.4 HE染色：取大鼠海馬組織，4%甲醛溶液固 定，常規石蠟包埋，經二甲苯、乙醇、蒸餾水洗脫后，蘇木精染色5 min，水洗后0.5%伊紅液染色 3 min，蒸餾水沖洗、脫水、干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬組織切片。

1.2.5 透射電鏡觀察大鼠海馬神經元自噬：參照文獻[10]方法置于電鏡下觀察大鼠海馬神經元自噬。

1.2.6 Western blot法檢測海馬組織自噬相關蛋白及PI3K/mTOR通路蛋白表達：取大鼠海馬組織，剪碎，加入蛋白裂解液于冰上充分裂解30 min，4 ℃、 12 000 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存備用。BCA法測定蛋白濃度，取40 μg樣品以10% SDS-PAGE電泳。電泳結束后半干法將分離的蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入HPR標記的二抗（稀釋度1:5 000），37 ℃孵育2 h。TBST洗膜后加入ECL化學發光顯色、曝光拍照。以β-actin為內參，BandScan軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦缺血再灌注不同時間大鼠神經功能缺損評分 與假手術組比，隨著腦缺血再灌注時間的延長，0～24 h組大鼠神經功能缺損評分呈增加的趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 腦缺血再灌注不同時間大鼠腦梗死面積 與假 手術組比，隨著腦缺血再灌注時間的延長，0～24 h組大鼠腦梗死面積呈現增加的趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 腦缺血再灌注不同時間海馬組織HE染色形態 假手術組大鼠海馬區神經細胞排列規整，結構完整，細胞核飽滿。隨著腦缺血再灌注時間的延長，大鼠海馬區神經元數量逐漸減少，細胞核固縮、碎裂現象逐漸嚴重，見圖3。

2.4 腦缺血再灌注不同時間海馬神經元超微結構

假手術組大鼠海馬神經元細胞核結構完整，染色質分布均勻，線粒體脊線清晰，自噬不明顯。隨著腦缺血再灌注時間的延長，海馬神經元染色質固縮，線粒體出現損傷，有自噬泡出現，且腦缺血再灌注時間越長，自噬泡數量越多，見圖4。

圖1 腦缺血再灌注不同時間神經功能缺損評分（每組n=5）

圖2 腦缺血再灌注不同時間大鼠腦梗死面積（每組n=5）

2.5 腦缺血再灌不同時間海馬組織自噬相關蛋白表達 與假手術組比，隨著腦缺血再灌注時間的延長，0～24 h組海馬組織LC3 II蛋白表達呈增加趨勢，p62 蛋白表達呈降低趨勢，差異有統計學意義（均 P＜0.05）；與假手術組比，隨著腦缺血再灌注時間的延長，0～36 h組海馬組織Beclin-1蛋白表達呈增加趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 腦缺血再灌不同時間海馬組織PI3K/mTOR通路相關蛋白表達 與假手術組比，隨著腦缺血再灌注時間延長，0～36 h組海馬組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達均呈下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）；與假手術組比，隨著腦缺血再灌注時間延長，0～ 12 h組海馬組織p-mTOR蛋白表達均呈下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

3 討論

缺血性腦卒中是全球主要的致死及致殘疾病之一，嚴重危害患者健康。腦缺血再灌注損傷在缺血性腦血管病病理生理過程中較為常見，其機制比較復雜，與多種病理環節相關，如自由基損傷、炎癥介質釋放、細胞凋亡和自噬等。

自噬是溶酶體介導的對體內受損細胞器及大分子物質進行降解的過程。正常生理狀態下的自噬可維持機體內環境穩態，調控細胞損傷及防止細胞 老化[11]，但自噬被過度激活后，則會造成細胞程序性死亡，引起一系列疾病[12]。研究發現，腦缺血再灌注大鼠海馬神經元變化與自噬密切相關。趙亞倩等[13]通過建立腦缺血再灌注大鼠模型發現腦缺血再灌注激活了大鼠海馬神經細胞自噬，導致神經元細胞嚴重損傷，在神經細胞內觀察到大量自噬小體。本研究結果顯示，隨著腦缺血再灌注時間延長，大鼠神經功能缺損評分增加，腦梗死面積增加，海馬區神經出現核固縮和碎裂現象，腫脹明顯，海馬區自噬小體數量增加，這與趙亞倩等[13]報道的結果一致。

圖3 腦缺血再灌注不同時間海馬組織HE染色

圖4 腦缺血再灌注不同時間海馬組織透射電鏡圖

圖5 腦缺血再灌不同時間海馬組織Beclin-1、LC3 II和p62蛋白表達（每組n=7）

圖6 腦缺血再灌注不同時間海馬組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達（每組n=7）

自噬發生過程涉及多種蛋白的表達變化，Beclin-1是酵母ATG6的同系物，是一種參與自噬的特異性基因。研究發現，Beclin-1在腦缺血再灌注期間發揮至關重要的作用，Beclin-1表達上調可增強自噬，促進自噬體的形成和成熟[14]。LC3是目前公認的自噬體標記物，分為I型和II型，I型常規表達并游離存在于胞質中。自噬發生時，LC3 I磷脂化形成LC3-PE，即膜結合形式的LC3 II，LC3 II位于胞內自噬體的膜上，其含量高低可反映自噬小體數量[15]。 自噬發生時，p62與泛素化的蛋白質結合后再與自噬小體內膜上的LC3 II蛋白形成復合物，一同在自噬溶酶體內降解。當自噬活性減弱或自噬功能缺陷時，p62 蛋白在細胞質中不斷累積，其含量高低可間接反映自噬小體清除水平[16]。SHU等[17]研究發現腦缺血再灌注大鼠Beclin-1和LC3 II蛋白表達顯著升高，電針治療可降低其蛋白表達，減輕自噬和細胞凋亡。WANG等[18]研究發現腦缺血/再灌注損傷后大鼠海馬CA1區自噬體數量、Beclin-1蛋白表達及LC3 II/LC3 I比率均顯著增加，p62蛋白表達顯著降低。本研究結果顯示，自噬相關蛋白beclin1、LC3 II表達均顯著上調，且再灌注時間越長，蛋白表達越高，提示腦缺血再灌注可激活大鼠海馬神經元自噬，再灌注時間越久，自噬越嚴重，與報道結果一致，說明腦缺血再灌注可激活大鼠海馬過度自噬，損傷神經細胞。

PI3K/mTOR信號通路在自噬中起關鍵的調節作用。在生理條件下，酪氨酸激酶受體被活化后可激活PI3K，底物PIP2被活化的PI3K催化為PIP3，PIP3進而與磷酸肌醇依賴的激酶-1協同作用激活Akt，p-Akt將信號傳遞至mTOR，活化后的mTOR（p-mTOR）激活其下游的相關因子，進而促進細胞蛋白質合成、增殖和生長，加速細胞代謝，抑制其自噬[19]。研究發現，七氟醚預處理可激活PI3K/Akt信號通路，增強下游mTOR活性，進而降低缺血再灌注期間心肌細胞的自噬水平，發揮心肌保護作用[4]。王潔等[20]研究發現，丁苯酞可能通過P53/mTOR通路減少細胞自噬反應，保護腦缺血再灌注后損傷。本研究結果顯示，缺血再灌注后，大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達均顯著下降，且再灌注時間越長，蛋白表達越低，提示缺血再灌注抑制了大鼠海馬區PI3K/mTOR信號通路。因此，通過藥物作用激活PI3K/mTOR通路促進mTOR活性，可能降低缺血再灌注大鼠海馬神經元自噬，起到腦保護的作用。

綜上所述，腦缺血再灌注不同時間可增強大鼠海馬神經元自噬，抑制PI3K/mTOR信號通路，但是具體作用機制還需要進行后續實驗。