姜黃素通過NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸對低氧性肺動脈高壓的干預作用

蔡學定，陳馬云，李文雅，吳佩亮，姚丹，黃曉穎

（溫州醫科大學附屬第一醫院 呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325015）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種以肺血管收縮與結構重塑為特征的慢性進展性疾病，病死率高[1]。肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）的異常增殖是肺血管結構重塑的主要原因，而多種炎癥反應參與其中[2-3]。目前已有研究探明姜黃素可通過Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3， NLRP3）炎性體相關通路調節炎癥反應[4]。姜黃素是否在低氧性肺動脈高壓（hypoxia induced pulmonary hypertension，HPH）疾病模型中通過NLRP3炎性體相關通路抑制炎癥反應從而抑制HPH未見報道。本研究通過建立HPH大鼠模型和低氧PASMCs模型，探討姜黃素通過NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸對HPH的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級健康雄性SD大鼠，購于上海斯萊克公司，體質量200～300 g，動物模型實驗在溫州醫科大學實驗動物中心進行，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2019-0009。DMEM高糖培養基、0.25% EDTA胰酶、胎牛血清、青/鏈霉素購于美國Gibco公司。RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、ECL超敏化學發光底物購于美國Thermo Pierce公司。姜黃素單體購于德國Merck公司。兔源性NLRP3抗體、兔源性Caspase-1抗體、兔源性IL-1β抗體購于英國Abcam公司。

1.2 動物分組及造模 將18只SD大鼠隨機分為3組（每組6只）：常氧組（N）、低氧組（H）、低氧+姜黃素組（HC）。N組大鼠均置于SPF環境中；H組大鼠造模時被放置于密封的低氧艙內，通過動態充入N2使艙內的O2濃度保持在9%～11%，在自動控制器的作用下將濕度維持在55%～65%，CO2控制在2%以下，低氧造模低氧時間為每日8 h，共造模4周。HC組大鼠進入低氧艙造模前，腹腔注射40 mg/kg姜黃素，N組、H組均腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。每日密切關注SD大鼠活動情況、飲食情況、精神狀態[5]。

1.3 細胞分離培養及分組造模 取SD大鼠，消毒及麻醉后在超凈臺內取得肺組織，分離出肺細小動脈，去除內皮細胞后剪碎，用含有1 mL 0.2%膠原酶I消化，待肺小動脈碎塊消化為絮狀物后離心，去上層膠原酶后加入培養基放置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。3 d后得到原代PASMCs，將細胞傳代至 4～6代時收集細胞用于實驗。細胞饑餓12 h使細胞周期同步化，之后進行干預。分為N組、H組、HC組（姜黃素濃度為10 μg/mL）。N組培養條件：37 ℃，5% CO2，21% O2，74% N2；H組培養條件：37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2；HC組培養條件：37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2，姜黃素（10 μg/mL）。3組培養時間均為24 h。

1.4 CCK-8法檢測細胞活性 將PASMCs制成單細胞懸液并接種至96孔板中，恒溫培養箱培養24 h。分組方式同前，每組6個孔，周邊設無細胞的空白組，分別置入相應培養箱進行培養。干預結束后，倒去培養液，每孔中加入培養基和CCK-8試劑，迅速避光放入培養箱中，1～2 h后快速放入酶標儀中進行檢測，設置酶標儀檢測波長450 nm，測量各孔的吸光度（absorbance，A）。

1.5 肺動脈壓力測定及右心肥大指標檢測 用20%烏拉坦腹腔注射麻醉SD大鼠，固定大鼠后分離右頸外靜脈，測壓管插管至肺動脈，生理記錄儀測得每只大鼠平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）[6]。大鼠放血處死，取出完整心臟，完整分離右心室（right ventricle，RV）、左心室和室間隔（left ventricle+septum，LV+S），吸干水分后稱重，記錄并計算右心肥厚指數=[RV/（LV+S）]，反映右心肥大情況。

1.6 肺血管結構重塑指標檢測 取大鼠右肺上葉放入4%多聚甲醛中固定24 h，肺組織常規石蠟包埋切片，行HE染色。制作好的HE染色切片在普通光學顯微鏡下觀察，隨機選取6個不同視野下的肺中小動脈拍照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析肺中小動脈管壁面積/管總面積（wall area to total area，WA/TA）以反映肺血管結構重塑的程度。

1.7 Western blot檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β相關蛋白表達 提取各組大鼠肺組織標本和PASMCs總蛋白，測定總蛋白濃度。取細胞蛋白樣品40 μg、組織蛋白樣品60 μg分別行凝膠電泳，轉膜至PVDF膜后，脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育一抗過夜。次日清洗后孵育二抗，漂洗后運行成像儀進行曝光。使用Quantity One測定各條帶的灰度值，以GAPDH為內參，各組目的蛋白與對應GAPDH灰度值的比值即為該組蛋白的相對表達量，比較各組蛋白的表達差異。

1.8 統計學處理方法 采用SPSS21.0統計軟件進行分析。計數資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組PASMCs數量比較 與N組（1.079±0.039）比，H組（1.326±0.060）PASMCs數量顯著增加，差異 有統計學意義（P＜0.05）；與H組比，HC組（1.158± 0.050）PASMCs數量顯著減少，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與N組比，HC組PASMCs數量差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠mPAP、右心肥大程度比較 與N組比，H組大鼠mPAP顯著升高，右心肥大指數明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與H組比，HC組大鼠mPAP明顯下降，右心肥大指數明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與N組比，HC組mPAP、右心肥大指數差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠mPAP和右心肥大程度比較（每組6只，

表1 3組大鼠mPAP和右心肥大程度比較（每組6只，

與N組比：aP＜0.05；與H組比：bP＜0.05

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2.3 3 組大鼠肺血管重塑程度的比較 與N 組（0.493±0.018）比，H組大鼠WA/TA（0.789±0.042）明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與H組比，HC組大鼠WA/TA（0.652±0.034）明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與N組比，HC組大鼠WA/TA差異有統計學意義（P＜0.05）。N組肺動脈平滑肌層未見明顯增厚，管壁均勻一致；H組肺動脈肌化明顯，管腔明顯狹窄，中膜平滑肌細胞明顯增生，管壁明顯增厚；HC組較H組肺動脈肌化減輕，管壁增厚好轉，管腔狹窄不明顯，見圖1。

圖1 3組大鼠肺血管HE染色圖（×400）

2.4 3組PASMCs和肺勻漿NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸相關蛋白表達量比較 與N組比，H組PASMCs的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達明顯升高，差異有統 計學意義（均P＜0.05）；與H組比，HC組PASMCs的 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與N組比，HC組NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2 和圖2。與N組比，H組大鼠肺勻漿的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達明顯升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與H組比，HC組大鼠肺勻漿的NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3和圖3。

表2 3組PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達量（每組6只，）

表2 3組PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達量（每組6只，）

與N組比：aP＜0.05；與H組比：bP＜0.05

組別 NLRP3 Caspase-1 IL-1β N組 0.191±0.037 0.184±0.070 0.030±0.011 H組 0.648±0.152a 0.629±0.076a 0.120±0.038a HC組 0.412±0.107ab 0.402±0.104ab 0.068±0.015ab

圖2 3組PASMCs NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白Western blot圖

3 討論

PH是一類以肺血管重塑和肺血管阻力增加為特征的進展性疾病，病死率高，預后欠佳。PASMCs的異常增殖是肺血管重塑的重要因素[2，7]，肺動脈炎癥反應在其中發揮重要作用[3]，目前臨床上針對PH的治療措施較為有限。抑制局部肺動脈炎癥及PASMCs異常增殖可以緩解甚至逆轉肺血管重塑和PH疾病進展，因此尋求該類的新型中藥單體，并深入探究其作用機制和有效靶點十分重要。

表3 3組大鼠肺勻漿NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達量（每組6只，）

表3 3組大鼠肺勻漿NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達量（每組6只，）

與N組比：aP＜0.05；與H組比：bP＜0.05

組別 NLRP3 Caspase-1 IL-1β N組 0.143±0.049 0.239±0.057 0.022±0.006 H組 0.284±0.030a 0.875±0.125a 0.064±0.008a HC組 0.210±0.019ab 0.587±0.088ab 0.040±0.005ab

圖3 3組大鼠肺勻漿NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白Western blot圖

姜黃素是從姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚，有研究報道其具有抗炎[4]、抗腫瘤[8]、抗氧化和心血管保護等作用。NLRP3復合體是一種大分子復合蛋白，由識別蛋白-NLRP3、銜接蛋白-凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）和Caspase-1 組成[9]。Nod樣受體（nod-like receptor，NLR）感知應激后聚集為NLRP3 寡聚體，通過ASC募集激活Caspase-1，將無活性的前體Caspase-1活化為剪切體Caspase-1（cleaved Caspase-1），cleaved Caspase-1可切割炎癥因子IL-1β并使之成熟和釋放，參與炎癥反應[9-10]，在缺血再灌注、遺傳性周期性發熱綜合征等疾病的發生發展中起到關鍵作用[11]。

至于PH相關研究領域，有報道稱Caspase-1可調控炎癥因子，參與PH的發生發展[12]；IL-1β可介導小鼠肺血管周圍的巨噬細胞募集，促進PASMCs異常增殖，造成肺血管重塑，與PH的疾病進展密切相關[13]。YIN等[14]研究報道姜黃素可以通過抑制NLRP3炎性體，進而抑制IL-1β的分泌，起到抗炎的作用。由于炎癥反應是低氧損傷的重要病理機制之一[15]，姜黃素可能通過抑制NLRP3炎性體，進而抑制Caspase-1的活化，從而減少IL-1β的成熟和釋放，減輕炎癥所致的PASMCs增殖，改善血管的重塑，最終降低HPH大鼠的肺動脈壓力。

本研究發現姜黃素可以有效降低HPH大鼠的肺動脈壓力，明顯改善右心肥大及肺血管重塑，抑制低氧誘導的PASMCs異常增殖。進一步探究其作用機制和具體靶點，發現姜黃素可降低HPH大鼠肺勻漿以及低氧PASMCs中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表達。姜黃素可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸減少低氧誘導的炎癥反應，從而改善低氧PASMCs異常增殖和HPH大鼠肺血管重塑，從而降低肺動脈壓力，對HPH有治療作用。