右美托咪定減輕皮質酮抑制神經干細胞的增殖作用及機制

潘一釗，馬君梅，黃堅堅，胡志妍，梅虹霞，林函，

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.麻醉與圍術期醫學科；2.浙江省麻醉學重點實驗室）

手術刺激會導致血漿糖皮質激素水平升高，直至術后第8天糖皮質激素水平才恢復正常，糖皮質激素濃度過高會損害神經發育并持續存在[1]。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）作為神經元的前體細胞，可以促進缺氧缺血損傷模型中受損的新生兒腦中的神經前體細胞遷移和分化，促進感覺運動功能的恢復[2]。而糖皮質激素暴露之后受損的神經細胞沒有因神經干細胞再生修復，因此我們考慮糖皮質激素暴露直接引起NSCs的發育受損。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）為腎上腺α-2受體激動劑，具有神經保護作用，呈劑量相關性減輕七氟醚、異氟醚暴露造成的神經細胞損傷[3-4]， 且DEX對氯胺酮造成的NSCs損傷有保護作用，但未見有關于DEX在皮質酮（corticosterone，CORT）暴露模型上是否具有保護作用的研究[5]。本研究采用CORT誘導NSCs損傷模型，探討DEX對NSCs的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 DMEM/F12和B27 supplement購自美國Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自美國Peprotech公司；CytoTox 96非放射性細胞毒性試劑盒購自美國Promega公司；Matrigel購自美國BD公司；CORT購自美國MCE公司；DEX購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。Click-iTTMEdUAlexa Fluor高通道顯像試劑盒、Trizol購自美國Invitrogen公司；小鼠神經上皮干細胞蛋白巢蛋白（Nestin）和兔胚胎干細胞關鍵蛋白（SRY-related HMG-box2，SOX2）抗體購自美國Abcam公司；兔GSK3-β抗體、兔p-GSK3-β抗體、兔β-catenin抗體、兔Cyclin D1抗體購自美國CST公司；兔β-Tubulin抗體購自美國Proteintech 公司；反轉錄試劑盒RR037A購自大連寶生物工程有限公司；鼠抗兔二抗購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs制備、鑒定和分組：SD大鼠，體質量250～350 g[溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（浙）2010-0044]。將雌雄SD大鼠置入交配籠里進行交配，將觀察到陰栓日記為孕第0天（E0）。分離E15胎鼠的皮質NSCs進行培養，培養基為含bFGF（2% B27，20 μg/L bFGF和20 μg/L EGF） 的DMEM/F12，培養條件為5% CO2、37 ℃。培養4～ 5 d后進行細胞傳代，穩定培養至第2代。將細胞接種于24孔板上，加入500 μL培養基，培養24 h后，進行Nestin及SOX2 免疫細胞化學染色鑒定，熒光顯微鏡拍照。在大鼠體內皮質酮作為糖皮質激素的活性形式存在，所以本實驗選取皮質酮代表糖皮質激素。進行乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性實驗及EdU法檢測神經干細胞增殖時，將NSCs分為Control組、DMSO組、CORT組（1 μmol/L CORT孵育24 h）和DEX組（0.01，0.1，1 μmol/L DEX預處理1 h后，再加入CORT繼續孵育24 h）。在機制探討部分，根據前期實驗結果，1 μmol/L DEX具有神經保護作用，所以選擇1 μmol/L作為DEX的濃度，具體分為對照組、DMSO組、CORT組（1 μmol/L CORT孵育24 h）和DEX組（1 μmol/L DEX預處理1 h后，再加入CORT繼續孵育24 h）。

1.2.2 反轉錄PCR法檢測α-2受體亞型在NSCs上的表達：將細胞接種于6孔板中，提取NSCs的總RNA，測定總RNA的濃度與A260 nm/A280 nm比值，將RNA反轉錄為cDNA進行PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物，EB染色，紫外線下觀察α-2A受體、α-2B受體、α-2C受體的mRNA表達的結果。其引物序列見表1。

1.2.3 LDH釋放法檢測細胞毒性：將NSCs接種于96孔板內并加入100 μL培養基，按1.2.1分組繼續處理24 h后，按照CytoTox96非放射性細胞毒性試劑盒說明書操作。

表1 引物序列

1.2.4 EdU法檢測神經干細胞增殖：將NSCs接種于24孔板上，細胞按1.2.1分組繼續處理24 h。最后 4 h加入0.1% 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）試劑，鏡下計數EdU陽性細胞數。EdU陽性率=EdU染色的增殖細胞數/細胞總數×100%，以此表示細胞增殖率。

1.2.5 Western blot檢測NSCs增殖相關基因的表達：將細胞接種于6孔板中，按1.2.1分組繼續處理24 h后，將蛋白裂解試劑加入至6孔板中，于冰上靜置，收集裂解液，超聲，低溫離心10 min，收取上清液。測定蛋白濃度，電泳、轉膜、封閉后，加入內參蛋白兔β-Tubulin抗體和目的蛋白兔GSK3-β抗體、兔p-GSK3-β抗體、兔β-catenin抗體、兔Cyclin D1抗體，按1:2 000的滴度稀釋，4 ℃搖床孵育過夜。對應二抗室溫孵育1 h；通過ECL顯色，X線膠片曝光成像。使用ImageJ軟件分析目標蛋白條帶和內參蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），以兩者IA的比值表示目標蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCs鑒定結果 圖1A顯示原代培養第二代的神經球，進行Nestin（紅色）和SOX2（綠色）免疫熒光染色鑒定，圖1B顯示基質膠鋪板后進行貼壁培養的NSCs，進行Nestin（紅色）和SOX2（綠色）免疫熒光染色鑒定，細胞核進行DAPI染色鑒定（藍色）。其中Nestin和SOX2共染細胞在DAPI細胞核染色的細胞中陽性率超過97%，免疫熒光染色結果證明培養的細胞為NSCs。

圖1 神經球（A）和單層NSCs（B）的Nestin（紅色）和SOX2（綠色）免疫熒光染色

2.2 α-2腎上腺受體亞型在NSCs上的表達 圖2所示為NSCs的總RNA進行RT-PCR后的凝膠電泳圖，結果證明腎上腺α-2受體的3個亞型α-2A、α-2B、α-2C在NSCs上均有表達。

2.3 CORT及DEX對NSCs的細胞毒性的影響 不同處理組間LDH的釋放量差異均無統計學意義（P ＞ 0.05），見圖3。說明CORT、不同濃度DEX不會對NSCs 造成損傷，對神經發生的影響與藥物的細胞毒性 無關。

2.4 DEX減輕CORT抑制NSCs的增殖 與Control組和DMSO組比，CORT組的NSCs增殖能力顯著被抑制（P＜0.05）。而0.1、0.01 μmol/L的DEX預處理對NSCs的增殖作用不明顯（P＞0.05），當劑量增加至1 μmol/L時，NSCs的增殖能力有所恢復（P＜0.05），見圖4-5。后續實驗僅檢測1 μmol/L DEX預處理對NSCs的影響。

2.5 DEX減輕CORT抑制NSCs的增殖相關蛋白表達

Western blot結果顯示，與Control組、DMSO組 比，CORT處理后p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1的蛋白相對表達量顯著下降（P＜0.05），而與CORT組比，DEX預處理后p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。Total GSK-3β蛋白在各組間的相對表達量差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖6-7。

圖2 NSCs總RNA進行RT-PCR后凝膠電泳圖

圖3 LDH釋放實驗檢測CORT和DEX對NSCs的細胞毒性（每組n=3）

圖4 EdU法檢測CORT和DEX對NSCs增殖影響的免疫熒光染色（綠色為EdU標記新增殖細胞，藍色為Hoechst標記總細胞，刻度尺為100 μm）

2.6 PI3K磷酸化抑制劑LY294002拮抗DEX對NSCs的促增殖作用 與Control組、DMSO組比，CORT組、CORT+1 μmol/L DEX組、CORT+1 μmol/L DEX+ LY294002組的NSCs增殖能力顯著被抑制（P＜0.05），而預先1 μmol/L DEX處理后，與CORT組比NSCs的增殖能力有所恢復，但給予DEX前再給予PI3K磷酸化抑制劑LY294002（LY294002抑制GSK-3β的磷酸化）后DEX的神經保護作用被逆轉（P＜0.05）。見圖8-9。

3 討論

本研究以NSCs為研究對象，觀察了DEX減輕CORT抑制NSCs的增殖作用。結果發現，1 μmol/L CORT會抑制NSCs的增殖，而1 μmol/L DEX可以減輕CORT對NSCs增殖的抑制。

糖皮質激素會對神經發育造成損傷，連續7 d給予新生鼠地塞米松導致齒狀回中NSCs（神經祖細胞）顯著凋亡，導致齒狀回體積的持續減小，耗竭神經祖細胞池[6]。將NSCs暴露于1 μmol/L地塞米松或1 μmol/L CORT中時，發現地塞米松和CORT都抑制了NSCs的增殖[7]。且地塞米松可以通過糖皮質激素受體，抑制GSK-3β蛋白Ser9 位點的磷酸化，促進GSK-3β與AXIN、APC形成復合物分解胞質內β-catenin，使β-catenin與核內LEF/TCF轉錄因子家族結合減少，抑制周期蛋白的表達[8]。據報道DEX可以通過PI3K/Akt和ERK1/2通路參與對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用，促進GSK-3β蛋白Ser9位點的磷酸化[9]，因此我們考慮DEX和CORT是否可能通過GSK-3β這一共同靶點起到相互影響的作用。

Wnt信號通路與新生神經元的發育有關，可以維持成年大腦內神經干細胞池，以及誘導新生神經元的分化，調節發育中大腦的突觸傳遞和可塑性及神經發生[10]。β-catenin是Wnt信號通路的主要效應物，當β-catenin被GSK3β、Axin和APC形成的復合物持續降解，導致胞漿內的β-catenin含量減少無法激活下游的LEF/TCF轉錄因子，使Cyclin D1的表達量減少[11]。GSK3β的Ser9 位點磷酸化可以抑制Axin和APC形成復合物分解β-catenin，然后促進β-catenin進入細胞核，從而激活下游的LEF/TCF轉錄因子，使Cyclin D1的表達量增加[12]。

圖5 EdU法檢測CORT和DEX對NSCs增殖率的影響（每組n=3）

圖6 CORT和DEX對NSCs中p-GSK-3β、Total GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達的印跡圖

在本研究中1 μmol/L CORT暴露后p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1的表達量減少，而總GSK-3β表達量沒有變化，所以推測CORT抑制NSCs增殖的能力可能是通過抑制GSK-3β蛋白的磷酸化實現的。 1 μmol/L DEX預處理后p-GSK-3β、β-catenin、 Cyclin D1的表達量增加，在DEX預處理之前通過LY294002抑制GSK-3β蛋白的磷酸化，DEX的保護作用受到了抑制。因此推測DEX通過促進GSK-3β的磷酸化，減輕CORT抑制NSCs的增殖。

綜上所述，CORT對NSCs增殖能力的抑制可能與GSK-3β蛋白的磷酸化有關。而DEX可以通過促進GSK-3β蛋白的磷酸化減輕CORT抑制NSCs的增殖。由于本研究為離體實驗，尚需進一步的動物實驗證明。

圖7 CORT和DEX對NSCs中P-GSK-3β、Total-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1相對表達量的影響

圖8 EdU法檢測CORT和DEX對NSCs增殖影響的免疫熒光染色（綠色為EdU標記新增殖細胞，藍色為Hoechst標記總細胞，刻度尺為100 μm）

圖9 EdU法檢測CORT和DEX對NSCs增殖率的影響