破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)增殖的影響＊

鐘志如，羅序亮，劉學(xué)艷，林蘭，王琳，李志斌

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科，南昌330006；2.江西省共青城市人民醫(yī)院外科，九江330401)

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥， 也是死亡率第一的癌癥[1,2]。乳腺癌的內(nèi)分泌治療是雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者綜合治療的重要組成部分， 主要包括拮抗雌激素受體類(lèi)藥物， 他莫昔芬(Tamoxifen ，TAM)憑借其低毒、經(jīng)濟(jì)、效應(yīng)作用持久成為ER+乳腺癌患者綜合治療的一線藥物[3]。 目前中藥作為乳腺癌輔助治療手段之一越來(lái)越受到重視。靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體，靈芝孢子粉是靈芝的生殖細(xì)胞，擁有靈芝全部的遺傳活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤等多種功能[4-6]。 多項(xiàng)研究顯示，靈芝孢子粉能通過(guò)各種途徑如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等達(dá)到治療腫瘤的目的[7]，并且已有大量應(yīng)用靈芝孢子粉治療各種腫瘤的研究報(bào)道[8-10]。 本研究旨在觀察破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性BALB/c-nu 裸鼠共40 只，4-6 周齡，體重18-25g，從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入， 裸鼠生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （湘）2013-0004，使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2017-0002，在SPF條件下飼養(yǎng)于南昌樂(lè)悠生物科技有限公司。 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。 實(shí)驗(yàn)中使用的破壁靈芝孢子粉，其經(jīng)銷(xiāo)方為北京萬(wàn)世堂中醫(yī)科學(xué)研究院 （每100g 含粗多糖0.60g，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)食健字G20110430，衛(wèi)生許可證號(hào)：魯衛(wèi)食證字（2007）第370000-000350 號(hào)）購(gòu)買(mǎi)，性狀為棕色細(xì)小粉末，實(shí)驗(yàn)時(shí)以生理鹽水配制成懸濁液。 實(shí)驗(yàn)用乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬（分子式：C26H29NO，CAS 登錄號(hào)：10540-29-1，EINECS 登錄號(hào):234-118-0） 由南昌樂(lè)悠生物科技有限公司提供，為白色粉末，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配制成懸濁液。RPMI 1640 培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA 胰酶等購(gòu)自Solarbio 公司。 胎牛血清 （北美） 購(gòu)自Gibco 公司。 湖南湘儀低速多管離心機(jī)TDZ5-WS（濟(jì)南云鵬醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和單細(xì)胞懸液的制備 細(xì)胞株MCF-7 復(fù)蘇后置于含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中， 在37℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時(shí)傳代。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 經(jīng)Trypsin-EDTA 胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，1000r/min離心5 min，用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞的濃度調(diào)至為2.5 ×107/ml,將細(xì)胞懸液裝于5ml無(wú)菌ep 管中備用。

1.2.2 動(dòng)物模型建立、 動(dòng)物分組及給藥方法 用1ml 注射器注射0. 2ml 的上述細(xì)胞懸浮液于每只裸鼠的右前肢肩胛部皮下。接種12 d 后，可見(jiàn)接種處微小隆起，并逐漸增大。 60 只裸鼠中有44 只出現(xiàn)腫塊，接種成功率為73.3% 。 接種后2 周將44只移植瘤接種成功的裸鼠隨機(jī)分成4 組， 每組11只。 分組完成后開(kāi)始給各組小鼠用藥，以灌胃的形式模擬口服給藥： 破壁靈芝孢子粉組500mg/kg 灌胃，1 次/d；他莫昔芬組4.6mg/kg 灌胃，次/2d；破壁靈芝孢子粉與他莫昔芬組聯(lián)合組同時(shí)給予破壁靈芝孢子粉和他莫昔芬 （濃度和給藥方法同上）；對(duì)照組相同體積的生理鹽水灌胃，1 次/d；連續(xù)21d。

1.2.3 觀察裸鼠成瘤情況 用藥后觀察裸鼠的一般狀況， 包括日常活動(dòng)、精神狀態(tài)、體重變化。 每3d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑( a)和短徑( b)，計(jì)算腫瘤體積( V),V =ab2 /2。 藥物處理21d 后,脫頸椎處死裸鼠，完整剝離腫瘤， 并稱(chēng)量重量和測(cè)量瘤體的體積。計(jì)算抑制率: 抑制率= ( 1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重) ×100% 。 最后，將小鼠腫瘤使用10%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)機(jī)械切片，厚度為4μm。

1.2.4 觀察瘤體HE 染色 切片后的腫瘤組織分別利用HE 染色及免疫組化染色：四組腫瘤組織均經(jīng)10%福爾馬林固定、切片、酒精脫水后以石蠟包埋，二甲苯脫蠟、酒精至水、經(jīng)過(guò)蘇木精-伊紅染色（HE染色），HE 染色后的切片在不同倍數(shù)的光鏡下觀察并描述和記錄細(xì)胞改變情況。

1.2.5 觀察瘤體免疫組化染色情況 四組標(biāo)本均采用免疫組化二步法檢測(cè)石蠟標(biāo)本切片中的ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 四種指標(biāo)的表達(dá)，抗體和試劑盒均購(gòu)自南昌樂(lè)悠生物科技有限公司， 以已知乳腺癌陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照， 以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，染色步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

免疫組化染色包括ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 四種指標(biāo)， 觀察并記錄每一種指標(biāo)的表達(dá)情況，并進(jìn)行計(jì)算對(duì)比。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 陽(yáng)性信號(hào)均分布于細(xì)胞核中，以出現(xiàn)黃色至棕色顆粒為陽(yáng)性表現(xiàn)， 計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，定量判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Prism 7.0 software (GraphPad, San Diego CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果以±sD 表示，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況 用藥前各組裸鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0．05)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有裸鼠均活動(dòng)良好，大小便及飲食正常，對(duì)外界刺激有良好的反應(yīng)，無(wú)死亡。 破壁靈芝孢子粉組和聯(lián)合組小鼠精神狀態(tài)較對(duì)照組和他莫昔芬組更好。

圖1 各組裸鼠（n=11）：對(duì)照組；破壁靈芝孢子粉組；他莫昔芬組；聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重變化

2.2 裸鼠體內(nèi)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響 用藥前各組腫瘤體積無(wú)顯著差異( P＞0．05)，每周測(cè)量腫瘤體積2 次以動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況， 用藥后對(duì)照組移植瘤體積進(jìn)行性增大， 而他莫昔芬和靈芝孢子粉組移植瘤體積增大稍緩慢， 聯(lián)合用藥組增大尤其緩慢（圖2）。 與對(duì)照組相比，各用藥組移植瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0001)，而聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0．05)，單藥組之間無(wú)顯著差異( P＞0．05)。給藥結(jié)束后將各組裸鼠安樂(lè)死，剝離裸鼠移植瘤（圖2），對(duì)其移植瘤進(jìn)行稱(chēng)重，比較各組平均瘤重，各實(shí)驗(yàn)組瘤重均低于對(duì)照組，其中破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組平均瘤重最低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。 計(jì)算并比較各組抑瘤率，其中破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組抑瘤率高于破壁靈芝孢子粉和他莫昔芬組（表1）。

2.3 各組瘤體組織形態(tài)學(xué)改變 將各組裸鼠移植瘤組織切片通過(guò)HE 染色光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組移植瘤細(xì)胞明顯異型性：上皮排列失去極性，細(xì)胞核形態(tài)改變，大小不一，染色顏色較深，染色質(zhì)糾結(jié)形成團(tuán)塊，圖像中可見(jiàn)明顯核仁，多見(jiàn)核分裂像。 破壁靈芝孢子粉組、 他莫昔芬組移植瘤細(xì)胞異型性較低， 出現(xiàn)紅染無(wú)結(jié)構(gòu)壞死區(qū)， 出現(xiàn)凋亡腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合組即破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組異型性最低，組織結(jié)構(gòu)明顯疏松，可見(jiàn)明顯紅染無(wú)結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，其面積較另外三組明顯增大，腫瘤細(xì)胞核深染、固縮、崩解，凋亡腫瘤細(xì)胞最多。 （圖3）。

圖2 各組裸鼠（n=11）：對(duì)照組；破壁靈芝孢子粉組；他莫昔芬組；聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）移植瘤生長(zhǎng)曲線（A）；各組裸鼠移植瘤重量對(duì)比（B）及移植瘤示意圖（C）

表1 裸鼠移植瘤重量及抑瘤率

圖3 各組裸鼠移植瘤切片HE 染色對(duì)比：A.對(duì)照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

2.4 各組免疫組化測(cè)量ERα、ERβ、Ki-67 及P53的陽(yáng)性表達(dá)情況 顯微圖像分析ERα 陽(yáng)性信號(hào)分布于細(xì)胞核中，出現(xiàn)黃色至棕色為陽(yáng)性表現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組、靈芝組、他莫昔芬組、聯(lián)合組胞核內(nèi)均未見(jiàn)黃色顆粒，呈陰性表達(dá)（圖4）。

顯微圖像分析ERβ 陽(yáng)性信號(hào)以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽(yáng)性，在對(duì)照組、靈芝組、他莫昔芬組及聯(lián)合組胞核內(nèi)可見(jiàn)少量棕黃色顆粒，其中聯(lián)合組ERβ 表達(dá)最低， 陽(yáng)性率表達(dá)為17.14%，對(duì)照組ERβ 陽(yáng)性表達(dá)為33.26%,靈芝組ERβ 陽(yáng)性表達(dá)率為37.00%,而在他莫昔芬組之中為30.35%，四組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.153>0.05）（圖5）。

Ki-67 為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色至棕色為陽(yáng)性，四組中胞核內(nèi)均可見(jiàn)黃色至棕色顆粒， 其中對(duì)照組中Ki-67 陽(yáng)性率表達(dá)為43.60%， 靈芝組為35.83%，他莫昔芬組為37.14%，聯(lián)合組Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)率為47.50%，4 組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.136>0.05）（圖6）。

P53 為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色至棕色為表達(dá)陽(yáng)性，在對(duì)照組、靈芝組、他莫昔芬組及聯(lián)合組胞核內(nèi)可見(jiàn)淡黃色至棕黃色顆粒， 其中對(duì)照組P53 陽(yáng)性率表達(dá)為84.17%， 靈芝組P53 陽(yáng)性表達(dá)為90.77%，他莫昔芬組P53 陽(yáng)性表達(dá)率為87.50%， 聯(lián)合組P53 陽(yáng)性表達(dá)率為66.67%， 該差別有意義 （P=0.006<0.05）（圖7）。

3 討論

圖4 各組裸鼠移植瘤切片免疫組化ERα 對(duì)比：A.對(duì)照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

圖5 各組裸鼠移植瘤切片免疫組化ERβ 對(duì)比：A.對(duì)照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

圖6 各組Ki-67 對(duì)比：A.對(duì)照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

圖7 各組裸鼠移植瘤切片免疫組化P53 對(duì)比：A.對(duì)照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

靈芝孢子是靈芝生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)的象淡霧狀的極其微小的孢子， 其主要成分有靈芝多糖、三萜類(lèi)化合物、生物堿類(lèi)、多肽及微量元素鋅、鍺、硒等，大量研究證明，靈芝孢子粉具有免疫抗腫瘤作用[11-14]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[15]、抑制腫瘤血管生成[16,17]、 抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]，GLS 抗腫瘤作用還可能與抑制TOPⅠ，TOPⅡ異構(gòu)酶， 抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶有關(guān)[19]。 本實(shí)驗(yàn)建立人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞皮下移植瘤細(xì)胞模型，觀察靈芝破壁孢子粉與他莫昔芬對(duì)乳腺癌移植瘤模型的影響。 本次研究結(jié)果顯示，破壁靈芝孢子粉能夠抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖，聯(lián)合使用他莫昔芬對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)增值的抑制作用更加顯著， 而這二者聯(lián)合使用能夠下調(diào)P53 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而繼續(xù)影響乳腺癌預(yù)后，然而二者聯(lián)合使用能夠使P53 蛋白表達(dá)下調(diào)這一點(diǎn)并未在以往的實(shí)驗(yàn)中引起關(guān)注。

P53 是重要的抑癌基因， 包括野生型和突變型，研究證明，野生型P53 可 抑制細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S 期，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞在新的周期復(fù)制或程序性細(xì)胞死亡中得到修復(fù)或恢復(fù)，從而抑制腫瘤的發(fā)生[20]。 由于野生型P53蛋白半衰期短，容易降解，所以檢測(cè)出的都是是突變型P53 蛋白。 P53 抑癌基因的突變或P53 蛋白的過(guò)度表達(dá)都提示預(yù)后不良[21]。 研究表明，P53 腫瘤蛋白表達(dá)越高, 越有可能發(fā)生淋巴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[22]。而本實(shí)驗(yàn)中正是對(duì)突變型P53 蛋白進(jìn)行免疫組化檢測(cè)證實(shí),破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬可以顯著降低P53 蛋白表達(dá)，提高乳腺癌的整體預(yù)后情況。

相比較于作為內(nèi)分泌治療首選用藥的他莫昔芬容易耐藥、副作用多等缺點(diǎn)，本研究中使用的破壁靈芝孢子粉作為中醫(yī)藥抗癌，具有價(jià)格低廉、副作用少、可接受度高、改善癥狀以及 調(diào)節(jié)免疫等優(yōu)點(diǎn)。 應(yīng)用中醫(yī)藥抗癌、預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移及改善惡性腫瘤預(yù)后，相對(duì)具有優(yōu)勢(shì)。 本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證破壁靈芝孢子粉具有一定抑制腫瘤生長(zhǎng)作用的同時(shí)， 預(yù)測(cè)了內(nèi)分泌治療期間聯(lián)合使用破壁靈芝孢子粉可能達(dá)到改善患者預(yù)后的作用。 有研究證明，經(jīng)過(guò)放療、化療及手術(shù)的乳腺癌患者， 除卻治療本身帶來(lái)的影響之外，還有可能會(huì)出現(xiàn)，諸如疲勞、疼痛、焦慮和抑郁的癥狀。 而靈芝孢子粉對(duì)于此類(lèi)患者患者可能有益，而并未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[23]。 破壁靈芝孢子粉與他莫昔芬聯(lián)合使用雖未明顯的增加其抗腫瘤效果， 但能夠顯著降低腫瘤P53 的表達(dá)從而存在潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果。 破壁靈芝孢子粉的功效仍然是可以值得肯定的， 在臨床治療中也將會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。