銅綠假單胞菌相關sRNA研究進展*

李虹霖 綜述，陳 茶 審校

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院檢驗醫學部，廣東廣州 510006)

細菌調控小RNA(sRNA)是一類長度為50～500個堿基的RNA，廣泛分布于各類細菌中，不含開放閱讀框，通常由基因間區轉錄而來，也有小部分位于基因編碼5′和3′UTR區[1]。sRNA通過堿基互補配對與靶基因或靶標蛋白質結合，影響信使RNA(mRNA)的穩定，從而參與基因的轉錄后表達調控，發揮多種生物學功能[2]。例如，在致病菌的新陳代謝、脂多糖修飾、生物膜形成、外膜蛋白合成、毒力產生、耐藥性和群體感應等多個方面發揮重要調控作用[3-4]。近年來，研究者主要通過生物信息學模型預測sRNA的存在和可能的靶點，隨著sRNA研究的深入，sRNA的功能研究逐漸成為研究熱點。然而目前針對sRNA特別是銅綠假單胞菌相關sRNA的研究大都停留在新的sRNA鑒定方面，僅有少部分sRNA的功能被闡明。本文將在現有的理論和研究基礎上，從銅綠假單胞菌相關sRNA的概念、分類、作用機制及生物學功能等方面進行闡述，旨在為銅綠假單胞菌sRNA進一步研究提供參考。

1 sRNA的分類

細菌sRNA的長度較短，其編碼基因大都位于基因間區。sRNA具有獨立的轉錄單元，轉錄產物通常不需要經過加工。按作用方式，大致可將sRNA分為3種:(1)與蛋白質結合的調控sRNA；(2)與mRNA相互作用的調控sRNA：反式編碼sRNA、順式編碼sRNA；(3)規律成簇間隔短回文重復序列系統(CRISPRS/Cas)相關sRNA。

2 細菌sRNA的作用機制

隨著生物信息及全基因組RNAseq技術的開發和改進，細菌中已鑒定的sRNA數量激增，但其在各種調控網絡中的功能表征仍處于起步階段。sRNA發揮調控作用，主要通過以下兩種方式：(1)與相應的靶mRNA進行堿基互補配對，阻礙或促進蛋白質的翻譯，以調控目的基因的表達；(2)與調控蛋白結合，影響蛋白構象，使其無法與靶mRNA結合，從而調控基因表達。

2.1sRNA與mRNA堿基互補配對 反式編碼sRNA與其靶基因起源于不同的轉錄位點，在染色體上的位置距離靶基因較遠，與靶基因僅有部分互補。反式編碼sRNA的一般機制是通過與Shine-Dalgarno(SD)序列或起始密碼子堿基配對來隔離靶mRNA的核糖體結合位點(RBS)，并且還可以與靶序列的編碼序列相互作用，抑制翻譯起始；與RNase形成核糖核蛋白復合體，作用于靶mRNA的RBS，降解靶mRNA，抑制翻譯[5-6]；大多反式編碼sRNA常與分子伴侶Hfq一起發揮調控作用。某些mRNA能夠在5′UTR端形成抑制翻譯的二級結構，而sRNA在Hfq的協助下能夠結合到這種mRNA的5′UTR，從而阻止這種二級結構的形成[7]。

順式編碼sRNA是由編碼靶mRNA的DNA鏈的互補鏈為模板進行轉錄的產物，存在一段序列與靶基因完全互補，具有高特異性、高親和力的特點。由于順式編碼sRNA的反義RNA與靶mRNA是互補的，因此它們可以自主地相互作用，從而對靶mRNA轉錄后翻譯進行調控。一般順式編碼的sRNA不需要Hfq輔助即可對靶mRNA進行調控。順式編碼的反義sRNA通常位于相應基因的UTR，在與靶mRNA形成二聚體后，通過改變其二級結構，從而影響mRNA翻譯[8]。具體調控圖，可見參考文獻[1-2]。

2.2細菌sRNA與蛋白相互作用 除堿基互補配對外，sRNA還可通過與蛋白質結合而發揮調控作用。以銅綠假單胞菌的6 S RNA及CsrB/RsmZ家族為例。

在細菌中，6 S RNA十分保守且能夠在穩定期積聚，它與σ70-RNA聚合酶能夠結合形成穩定絡合物，而這種結合依賴于6 S RNA的二級結構——大型中央隆起兩側的螺旋，類似于開放的啟動子。然而，6 S RNA過表達或敲除無法引起細菌表型變化，對其功能研究還需不斷探索[9]。轉錄因子CsrA通過與sRNA CsrB、CsrC特異性結合，減少CsrA與目標mRNA結合機會，封閉它的sRNA轉錄后水平調控，從而抑制目標mRNA的翻譯。RsmX、RsmY、RsmZ等這類sRNA能調節銅綠假單胞菌Rsm系統中RsmA、RsmE RNA結合蛋白，并且GacS/GacA能激活RsmX、RsmY及RsmZ的表達[3,10]。在銅綠假單胞菌中，RsmZ家族主要調控T3SS分泌、細菌運動和生物膜形成等[11]。同時，CsrA/RsmZ在碳代謝、毒力、糖異生等多種生理過程中發揮調控作用[12]。此外一類作用于碳代謝相關基因的sRNA CrcZ/CrcY，可通過與Hfq一起結合，通過碳分解代謝物阻遏使銅綠假單胞菌適應環境，但具體機制不明[4]。

2.3與CRISP/Cas系統相關的sRNA 許多原核生物存在CRISP/Cas系統，其包含許多細菌的遺傳基因元素，是一種RNA介導的用于外源遺傳物質降解的適應性免疫防御系統[13]。最新研究發現，存在一類與CRISP/Cas有關的sRNA。一般而言，CRISPR位點由幾個短的直接重復序列組成，由25到40個堿基對的獨特序列分隔，Cas基因與CRISPR重復序列相連，兩者之間存在前導序列發揮啟動子作用，轉錄產生的非編碼RNA命名為CRISPR RNAs(crRNA)，CRISPR/Cas系統利用與特定Cas蛋白關聯的CrRNAs識別和消除外源噬菌體及質粒等遺傳物質[14]。研究者利用CRISP/Cas系統可對基因進行編輯的特點，使其在基因組水平上的基因改造、轉錄調控與表觀遺傳調控等不同層次上得到快速的發展與應用。

3 銅綠假單胞菌相關sRNA的生物學功能

細菌在面對生存環境的改變如溫度波動、有氧到厭氧的環境轉換、pH值、碳源改變及抗菌藥物作用等，通過sRNA調控自身狀態以適應環境的變化。例如，在新陳代謝、脂多糖修飾、生物膜形成、外膜蛋白合成、毒力產生、耐藥性和群體感應等多個方面發揮重要調控作用。目前，銅綠假單胞菌相關sRNA的研究大都停留在新的sRNA鑒定方面，僅有少部分sRNA的生物學功能被闡明。整理現有的理論和研究基礎，可對其生物學功能總結如下。

3.1氧化應激 在銅綠假單胞菌中，sRNA PhrS啟動子含有一個保守的ANR盒——氧化反應轉錄調節因子，PhrS在缺氧條件下具有獨立的誘導作用。在氧缺乏時，PhrS通過與pqsR上游170個核苷酸的開放閱讀框結合而促進pqsR的翻譯[15]。在不同濃度H2O2刺激實驗中發現，sRNA RgsA能夠增強銅綠假單胞菌的抗氧化應激能力[16]，但具體機制沒有揭示。近期有研究發現，RgsA在RNA酶RpoS的調節下使轉錄調控因子Fis和酰基載體蛋白mRNA的表達下調，而rpoS編碼的σS亞單位在細菌的氧化應激中扮演重要角色，而這與氧化應激是否有關還需進一步驗證[17]。

3.2碳代謝 細菌碳的吸收和利用是由一種被稱為碳分解代謝抑制(CCR)的機制所控制的。在銅綠假單胞菌中，Hfq是CCR轉錄后的主要調節因子，其通過與編碼碳利用相關酶的mRNAs RBS中富含A的序列結合，來阻止核糖體的負載。在碳源較少時，銅綠假單胞菌中的CrcZ合成得到增強，抑制碳代謝而適應環境的改變[4]。

3.3鐵代謝 機體一般通過限制細菌對鐵離子利用來抵抗感染。大多數病原菌的鐵調控蛋白——Fur，可參與sRNA對鐵的調控。在銅綠假單胞菌的基因間區存在sRNA PrrF，它包括2個95%以上的同源序列PrrF1和PrrF2，同時研究者在其上找到了Fur結合位點，與Fur蛋白一起調節銅綠假單胞菌體內的鐵代謝[18]。在高鐵環境下，Fur與Fe2+結合，抑制PrrF的編碼，減少細菌對儲存鐵的利用；在低鐵環境下，Fur與Fe2+脫落，誘導PrrF的產生，從而增加儲存鐵的使用，也可增加對鐵的攝取。同時PrrF1、PrrF2以及兩者間的基因序列能一起編碼sRNA PrrH。PrrH轉錄起始于PrrF1的5′端，終止于PrrF2的3′末端，全長325個堿基[19]。研究發現，相對于PAO1野生株，PrrF1/PrrF2敲除株在低鐵培養基中生存能力下降，毒力降低；動物實驗也顯示接種PrrF1/PrrF2敲除株的小鼠，在急性肺部感染期間細菌載量減少。然而，目前還沒有研究證實PrrF和PrrH影響銅綠假單胞菌毒力的具體作用機制，需要進一步的研究去闡釋。

3.4生物膜形成 細菌處于不利條件時，將合成由多糖蛋白質和核酸組成的生物膜，黏附在固體表面。生物膜使細菌在代謝、物質利用等方面具有獨特優勢，對抗菌藥物和宿主免疫防御的抵抗性增強。在銅綠假單胞菌中，存在受雙組分調節系統GacS/GacA控制的CsrB/RsmZ，其主要調控T3 SS的分泌、細菌的運動和生物膜等[11]。同時，PrrF1、PrrF2和PhrS也能夠調控群體感應系統中喹諾酮信號分子(PQS)的合成，其對銅綠假單胞菌群體的生物膜形成有一定影響[20-21]。有研究發現，在大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中，存在的sRNA MtvR負調控Hfq。這種負調控與hfqEc的5′UTR區結合有關。MtvR在大腸埃希菌 和銅綠假單胞菌中的表達能夠調控多種表型，包括生物膜形成能力降低以及對各種抗菌藥物敏感。

3.5外膜蛋白形成 細菌外膜(OM)是一種選擇性屏障，用于廢物的排出和少量營養物的進入，這一特性對于細胞在不利的環境中生存至關重要[22]。研究發現，大腸桿菌sRNA OmrA與OmrB通過下調幾種外膜蛋白(OmpT、CirA、FecA和FepA)的合成以重組外膜[23]。典型的OMP是由ompF和ompC基因編碼。在滲透壓變化時，sRNA MicF和MicC分別抑制mRNA編碼的OmpF和OmpC的翻譯，從而調控細胞膜孔隙的大小以適應環境[24]。此外，在細菌應激過程中，sRNA RybB和MicA的轉錄被激活，其下調大腸桿菌中OmpC和OmpA等主要OMP的合成，從而減少未組裝的周質OMP的積累[25]。然而在銅綠假單胞菌中有關調控外膜蛋白形成的相關sRNA研究尚少。

3.6群體感應 群體感應(QS)即細菌通過分泌一種或者多種酰基高絲氨酸內酯(AHLs或HSL)小分子，促進細菌個體間相互交流，協調群體行為的現象。QS一般由4部分組成：las、rhl、pqs和iqs[26]。細菌通過QS可以調控銅綠假單胞菌的運動、毒力產生、生物被膜形成及抗菌藥物耐藥等多種生理過程[27]。sRNA與QS系統存在著一種相互調控的關系。Gac/Rsm系統對正酰基高絲氨酸內酯(C4-HSL)和細胞外毒力因子(如氰化氫、花青素和彈性蛋白酶)的表達有積極的調節作用[28]。PrrF1、PrrF2通過抑制編碼降解鄰氨基苯甲酸的mRNA antABC而抑制鄰氨基苯甲酸降解，從而促使PQS信號分子產生。PhrS與pqsR通過堿基互補配對直接促進pqsR的轉錄，PQSR蛋白直接作用于表達PQS信號分子合成的操縱子pqsABCDE，編碼的酶能轉化鄰氨基苯甲酸為PQS信號分子[15]。近期有研究發現，ReaL受las系統的LasR負調控，并且通過轉錄后調控pqsC正向調控PQS信號分子的合成[29]。現在研究大部分集中于sRNA對PQS系統的調控，而對其他QS系統的研究較少。因此，sRNA與QS系統之間的調控關系仍然還需要大量的研究去探索。

3.7毒力因子產生 銅綠假單胞菌為適應環境，會產生外毒力因子，如氰化氫、吡咯烷、綠膿素和彈性蛋白酶等，而這些均與其毒力有關。以往研究表明，sRNA能調節毒力相關靶mRNA的穩定性或表達，以調控細菌對宿主的侵襲力。銅綠假單胞菌需要大量復雜的調控元件來控制其毒力系統的表達，如最近一份研究報告顯示雙組分AlgZR調控系統控制著幾種重要毒力表型的表達，如鐵依賴基因σ因子pvds、PrrF1、PrrF2、吡咯烷以及綠膿素[30]。目前，在有關銅綠假單胞菌相關sRNA功能研究的報道中，對綠膿素等表型的調控機制研究較少。

3.8細菌耐藥 抗菌藥物作為一種威脅細菌生存的環境壓力，會誘導相應抵抗機制產生。KIM等[31]利用過表達手段發現，17個Hfq依賴的sRNA調控了大腸埃希菌對抗菌藥物的敏感性，而敲除其中4個sRNA能逆轉相應的表型。更重要的是，過表達sRNA RyeB能增強左氧氟沙星對泛耐菌株的抑制效果，這提示sRNA可能是影響細菌對抗菌藥物的抵抗作用。抗菌藥物脅迫下產生的sRNA譜可通過管理細菌的各種生理過程來調控細菌耐藥。研究發現，在銅綠假單胞菌中，阿奇霉素能抑制RsmY/Z的轉錄，并且其對阿奇霉素的敏感性增加，這可能與銅綠假單胞菌 QS及生物膜的形成被阻斷有關[32]。目前，尚無研究結果直接表明sRNA調控各種生理過程來調控細菌耐藥，而這種潛在的密切聯系值得進一步探究，利于為發展以sRNA為靶點的抗菌藥物提供理論依據。

4 展 望

作為致病菌諸多調控網絡的關鍵組成部分，sRNA已引起人們的關注。同時，隨著生物信息學的發展，許多銅綠假單胞菌相關sRNA被發現,然而目前針對sRNA各方面的研究一直停留在表型層面，并未對sRNA的功能及其作用機制做出深入研究。今后研究者應加深對銅綠假單胞菌相關sRNA功能和作用機制的探討，這將有助于闡明sRNA在細菌體內的精細調控作用，促使人們對sRNA分子參與的翻譯調控和轉錄后加工產生更深的認識，最終豐富人們對細菌耐藥機制的認知，以便推進抗菌治療的發展。