NK細胞治療肝臟惡性腫瘤療效評價的安全性及有效性

李莉 周豐 王曉今 徐以兵 施莉琴 李震宇 周桁 傅青春 陳成偉

肝惡性腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，由于其早期發現率較低，多數患者就診時已達中晚期，失去手術或放、化療的最佳時機，生物免疫治療是近幾年備受青睞的腫瘤治療新技術。NK細胞治療是其中的一種，NK細胞是具有直接殺傷功能的天然免疫效應細胞，在清除腫瘤細胞中起關鍵作用。有研究表明,NK細胞治療聯合傳統腫瘤治療手段能夠有效提高腫瘤治療效果[1]。謝云波等[2]指出，同種異體NK細胞治療原發性肝細胞癌有很好的安全性和有效性。本研究采用異體NK細胞治療肝惡性腫瘤患者10例，觀察其安全性和有效性。

資料與方法

一、研究對象

10例患者為2016年1月至2017年5月在905醫院肝病中心接受NK細胞治療且定期隨訪者，其中男性7例，女性3例；中位年齡為61.5歲。原發性肝癌6例，轉移性肝癌4例。既往治療：手術切除聯合介入治療5例，介入聯合射頻消融治療3例，化療聯合介入治療2例。本研究方案由905醫院倫理委員會批準(總后批件號：衛醫療[2014]67號)及指導。

二、納入標準

①本人或其法定代理人簽署《知情同意書》；②年齡18～70歲；③經影像學或病理學確診為肝臟惡性腫瘤，符合下列任一條：a.腫瘤直徑≥5 cm或2個以上腫瘤且至少有一個直徑≥3 cm，行手術完全切除，1個月后常規TACE治療，無復發且無遠處轉移；b.未行手術切除或手術切除后復發，單個腫瘤直徑≥3 cm或多個腫瘤，TACE/消融后1個月，影像學檢查顯示病灶無活動，無遠處轉移；c.轉移性肝癌符合條件a或b但原發灶無活動性且無其他處轉移；④Child評分為A級或B級者；⑤外周血白細胞數>3×109/L；⑥患者一般狀況可，生存預期在3個月以上。

三、排除標準

①高度過敏體質或有嚴重過敏史，尤其對IL-2過敏者；②休克，全身衰竭，生命體征不正常，以及不能配合檢查者；③有精神或心理疾病不能配合治療及療效評估者；④T淋巴細胞癌/瘤；⑤全身感染或局部嚴重感染需抗感染治療患者；⑥合并心、肺、腦、腎、肝等重要臟器的功能障礙；⑦凝血功能障礙性疾病(如血友病)；⑧傳染性疾病(如HIV、RPR、活動性結核等)；⑨妊娠期或哺乳期婦女，或半年內有妊娠計劃的婦女；⑩正在使用免疫抑制藥物或器官移植后長期服用抗排異藥的患者；B嚴重自身免疫性疾病患者。

四、NK細胞培養

采集供者(患者直系親屬年齡為18～50歲)外周血100 mL，予上海宇研生物技術有限公司進行NK細胞培養及質控檢查。

五、NK細胞治療方案

細胞培養2周后，開始進行NK細胞回輸治療，每天1次，每次NK細胞數量均為1×109個/100 mL,連續2次為1個療程，共3個療程，每個療程間隔1個月。受試者分別在第一療程首次細胞輸注后的3個月、6個月、9個月、1年進行有效性的訪視觀察，整個臨床研究觀察持續3年。

六、療效評價

1.安全性評價

(1)不良反應觀察：靜脈回輸過程中及回輸后24 h內密切觀察患者是否出現發熱、皮疹、乏力、肌肉酸痛、嘔吐等不良反應。

(2)生活質量評估：用KPS評分及睡眠、食欲等的改變來評估生活質量的改善。

(3)臨床相關指標的檢測：治療前后常規檢查患者血常規(白細胞、中性粒細胞、單核細胞、血小板)，血生化(GLU/ALT/AST/A/TBil/DBil/Cr/BUN/)。

2.細胞治療前后循環腫瘤細胞(CTC)計數的變化：輸注后24 h CTC計數變化。

3.療效評價方法：患者治療前和治療后每3個月對病灶進行CT或MRI掃描，評估病情。臨床療效根據實體瘤療效評價標準:分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩定(SD)和疾病進展(PD)。以CR+PR(%)計算有效緩解率(ERR)。

七、統計學方法

結 果

一、 安全性評價

1.不良反應觀察：1例患者細胞輸注后半小時出現畏寒、寒戰、胸悶，給予對癥處理，15 min后癥狀緩解體溫升高，最高至39.9℃，伴惡心、嘔吐，予以胃復安及泰諾處理后，癥狀逐漸消失，次日有輕度肌肉酸痛；1例出現失眠；其余患者耐受性較好，均無其他嚴重不良反應。

2.生活質量評價：治療前KPS評分為81.0±13.7，治療后KPS評分為87.0±11.9，差異無統計學意義(P>0.05)。其中5例患者疲倦、乏力及精神、食欲不振等臨床癥狀有明顯改善。

3.肝腎功能相關指標：治療前后患者血常規(白細胞、中性粒細胞、單核細胞、血小板)，及肝腎功能(GLU/ALT/AST/A/TBil/DBil/Cr/BUN/)檢測均無明顯改變。

二、治療前后CTC計數的變化

10例患者輸注后24 h測CTC數減少，回輸前為3～5個/mL，回輸后為1～3個/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。

三、療效評價

10例均接受異體NK細胞治療，所有患者經治療后隨訪3～36個月，經CT及MRI檢查，臨床療效為：3個月總體生存率100%，有效緩解率80%(無死亡，2例SD，3例PR，5例CR)，6個月總體生存率90%，有效緩解率80%(1例死亡，1例PD，3例PR，5例CR)； 12個月總體生存率80%，有效緩解率60%(2例死亡，2例PD，3例PR，3例CR)；36個月總體生存率50%，有效緩解率30%(5例死亡，2例PD，3例CR)。

討 論

據統計2015年我國肝癌新發病例和死亡病例分別占惡性腫瘤的第四位和第二位[3]。肝癌早期診斷困難，病情進展迅速，盡管目前肝癌的診斷治療不斷取得進展，但進一步提高療效，特別是改善中晚期患者的預后仍面臨很多挑戰[4]。NK細胞占肝臟淋巴細胞總數的25%～50%，在肝臟免疫中發揮重要作用，NK細胞的衰竭和細胞因子的產生受損可能是肝癌發生的預測因子，肝癌患者外周血中的NK細胞數量與患者存活率和預后密切相關[5]。研究表明，肝癌患者的NK細胞活性顯著降低，提高NK細胞活性有助于預測肝癌患者肝切除術后的復發和預后[6]。目前增加NK細胞數量、提高NK細胞活力成為靶向NK細胞免疫治療的主要策略，如通過NK細胞過繼轉輸、免疫抑制劑、基因修飾NK細胞及使用雙特異性或三特異性抗體等增加NK細胞數量、增強NK細胞靶向性及NK細胞活性。NK細胞不僅能直接殺傷惡性病變細胞,還能參與調節免疫細胞應答,在多種腫瘤免疫治療策略中發揮了作用。研究表明，NK細胞治療對不同腫瘤的療效存在差異，在血液腫瘤的治療中發現，NK細胞聯合干細胞治療使患者2年的生存率達到36%，較單獨使用干細胞治療2年生存率(約15%)明顯提高，可使白血病患者無病生存期延長平均1.5年，對于復發難治型白血病可獲得高達40%的完全緩解率[7-9]。單獨使用NK細胞治療實體瘤效果欠佳，在有關直腸癌、食管癌、腎癌、胃癌等臨床試驗中，NK細胞過繼治療臨床應答不佳[10]。實體瘤治療效率低的主要原因考慮與腫瘤微環境的免疫抑制作用有關[11]。因此，推測NK細胞聯合療法可能會增強療效。而傳統腫瘤治療手段包括手術、放化療，可以在一定程度上降低腫瘤負荷，也可以提高腫瘤細胞免疫治療療效。

本研究對10例肝惡性腫瘤在常規治療的基礎上進行異體NK細胞治療，有1例患者在輸注1 h內出現畏寒、寒戰、發熱、惡心、嘔吐等癥狀，對癥處理后癥狀緩解，絕大多數無其他嚴重不良反應，有較好的耐受性；多數患者乏力、食欲不振及精神狀態差等臨床癥狀有明顯改善，患者短期內一般情況得到改善；此外，NK細胞回輸24 h后，患者外周血中的CTC減少,由輸注前3～5個/mL下降至1～3個/mL。Zhou等[12]的研究發現,手術前CTC及調節性T細胞計數較高的肝癌患者發生術后復發的風險高于低計數水平患者,且EpCAM+CTC≥2.22/mL是 患者術后1年內復發的獨立危險因素。Hao等[13]的研究結果則顯示,EpCAM+CTC≥3.5個/mL的肝細胞癌患者手術切除后的復發率高于<3.5個/mL的患者。也有研究顯示,肝癌細胞在疾病早期即可從實體瘤中脫離并進入外周循環而成為CTC,即使在未發生遠處轉移的情況下,肝癌患者的CTC計數亦可長期處于較高水平,且CTC計數在肝細胞癌的臨床診斷及預后評估中也具有較高的價值[14-15]。本研究納入病例數較少，NK細胞治療對于肝癌復發及預后的遠期影響，還需要通過加大樣本量、隨機對照試驗、增加NK細胞療程等進一步加以證實。