腸道微生物組學和代謝組學用于酒精性肝病精準診斷及治療的價值

韓白乙拉 常冰 王炳元

部分持續過量飲酒(折合純酒精，女性>40 g/d、男性>60 g/d)短期內可發生酒精性肝炎(AH)。AH的自然病程研究仍較有限，發病機制尚不十分清楚[1]。近年來研究表明，酒精及其代謝產物乙醛不僅可導致肝細胞損傷，更重要的是引起腸道微生物多樣性改變，損傷腸道黏膜的完整性和先天免疫功能，其結果導致腸黏膜屏障破壞，增加腸道通透性(腸漏)。失調的腸道微生物群及其代謝產物通過被破壞的細胞間連接直接進入門脈系統，可能是發生酒精性肝病(ALD)的基礎和重要原因[2]。移位的微生物種類和數量決定于飲酒者腸道“核心微生物群”的種類和數量[3]。由于方法學的限制，迄今尚無理想的定量核心微生物群方法。

一、飲酒與腸道微生物群

腸道微生物群是人體最龐大而復雜的微生物群落,也是人體的重要代謝“器官”。有益的腸道微生物和噬菌體與宿主形成共生關系，通過各種機制促進宿主防御，參與腸道的消化、分泌、吸收和新陳代謝，以及調節宿主的免疫功能等。腸道細菌的數量和質量變化、腸道通透性改變以及細菌產物(如內毒素)與實驗性和人類疾病中ALD的發生甚至肝硬化的進展密切相關[3]。腸道微生物群的定量可以作為ALD早期生物標志物和潛在的臨床治療藥物[4]。

任何形式的飲酒均可導致腸道微生態失衡，似乎中度飲酒更易造成酒精性肝硬化(AC)。 患者小腸細菌過度生長(SIBO)，后者與 AC 的嚴重程度密切相關。AC 患者長期應用質子泵抑制劑似乎會增加腸道鏈球菌科、糞便的毛螺旋菌和厚壁菌門下的瘤胃球菌科的數量，加劇內毒素血癥和細菌移位[1]。無菌小鼠(C57BL/6)比普通小鼠對酒精性肝損傷的易感性更高。說明完全缺乏腸道微生物群和微生物群失衡都容易導致ALD的發生。研究人員試圖將酒精抵抗的鼠糞菌作為供體，移植到對酒精敏感的鼠或用益生元來治療酒精誘發的肝損傷[5]。

酒精還可導致胃腸蠕動減少、胃內pH值增加，進一步促進SIBO，后者可導致長鏈飽和脂肪酸合成減少，小腸內擬桿菌門和厚壁菌門的數量明顯降低，革蘭陰性菌(如變形菌門)和革蘭陽性菌(如放線菌門)數量明顯增加，導致內毒素血癥[6]。通過細菌的16s rRNA區域序列分析發現， AC患者糞便中的普雷沃氏菌科數量比乙型肝炎肝硬化患者或健康人群明顯增加，即腸道優勢菌被抑制，少數致病菌菌種過度繁殖，腸道生理功能受損[3]。

二、腸道微生物的測定

腸道微生物在健康或疾病個體中的作用常常是從糞便中推測出來的。糞便檢測包括微生物多樣性、密度和豐度，容易取樣。糞便微生物分析是確定腸道微生物群與宿主健康和疾病之間關系的常用方法，其依據是糞便代表了整個腸道的大部分微生物種群[4]。但是，胃腸道是一個多器官系統，微生物具有很大的區域多樣性，每一個器官所在的位置都專注于特定基因功能表達，調節復雜且多樣化的消化、免疫、代謝和內分泌過程[4]。研究者一直在尋找如何取材方便、并能反映胃腸道整體微生物瞬時變化的方法，以便于發現瞬時變化與疾病的因果關系。

大多數微生物生態學分析旨在確定與應激源或疾病相關的特定微生物組，常使用高通量標記基因或鳥槍法(shotgun)宏基因組學數據來測量微生物群落特性，如豐富度(指一個群落或生境中物種數目的多寡)、均勻度(指一個群落或生境中全部物種個體數目的分配狀況，它反映的是各物種個體數目分配的均勻程度)和β-多樣性(指沿環境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性或物種沿環境梯度的更替速率，也被稱為生境間的多樣性)。

Smirnova等[1]根據美國國家酒精濫用和酒精中毒研究所(NIAAA)AH的共識定義和嚴格的排除標準，最后納入78例受試者進行研究。其中健康對照(HC)組24例，酗酒對照(HDC)組20例，中度酒精性肝炎(MAH)組10例，重度酒精性肝炎(SAH)組24例。對受試者的糞便樣本進行16s rRNA基因測序、多標簽測序(MTS)、主坐標分析(PCoA)、PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)分析、隨機森林分類和回歸模型等，分別建立AH和終末期肝病(MELD)評分的預測模型，推斷功能性基因組學；采用液相色譜-質譜聯用儀測定糞便樣品中的短鏈脂肪酸(SCFAs)濃度，評估應激源(慢性高劑量酒精)和疾病(AH)引起的腸道微生物組學和代謝組學變化[1]。

三、研究結果和意義

(一)酒精影響腸道細菌的種類 與HC組相比，HDC組富含厚壁菌并伴有明顯的擬桿菌減少；從HDC組、MAH組到SAH組，厚壁菌豐度呈階梯式下降。從HC組、HDC組、MAH組，變形桿菌的比例略有增加。然而，與HC組和HDC組相比，SAH患者的變形桿菌比例顯著增加。

(二)酒精影響細菌的多樣性 細菌的多樣性在對照組之間沒有顯著差異，但隨著AH的加重，多樣性有減少趨勢，意味著多種正常功能喪失，肝臟保護作用與損傷因素間的平衡打破，從而增加對酒精損傷的易感性。

(三)酒精影響腸道SCFA的產生 靶向代謝組學技術分析SCFA結果表明，AH患者的SCFA降低，產生SCFA的微生物菌水平降低。

(四)腸道菌群的差異提示AH可能有更多的微生物亞群 幾例HDC患者的微生物組成與AH患者相似，也有幾例MAH或SAH患者微生物組成與HDC相似，意味著根據糞便微生物組的不同，在臨床定義為AH的人群中可能存在亞群。

(五)其他 不同藥物治療可導致患者糞便微生物組出現差異；盡管微生物組組成隨AH的發展而變化，但它并不是疾病嚴重程度的預測指標；酒精影響腸道細菌基因組的功能，影響多條能量代謝途徑，包括多種氨基酸、含氨基糖、核苷酸糖、淀粉和蔗糖、鞘脂代謝等。該項研究提供了因酗酒而引起的糞便微生物組變化以及與AH相關變化的新信息，也提供了關于糞便微生物組和代謝組學的結果與疾病發展之間的新見解，為AH疾病的治療提供新的思路[7]。

四、研究的局限性

(1)在臨床診斷AH時，一些患者可能已合并肝硬化，而另一些患者可能僅為AH[8]，還有一些患者有失代償性肝硬化，以及與失代償期肝硬化相關的并發癥，包括感染、腹腔積液和肝性腦病等，同樣會誘發腸道微生物失調，在這項研究中未被提及；(2)該研究中登記的飲酒患者在收集糞便樣本時的疾病嚴重程度和環境各不相同。大多數HDC受試者在門診采集糞便樣本，而AH患者在入院后72 h內采集糞便樣本。代謝應激本身會導致腸道微生物群發生變化，這種變化發生在代謝損傷后的早期，并且可能會持續到住院期間[4]。另外，同一個人的腸腔菌群和黏膜菌群組成明顯不同，人與人、地區與地區以及性別之間的腸腔菌群也不同。糞便樣本不一定能全面反映腸道所有部位菌群(腸腔菌群和腸黏膜定植菌群)。在ALD患者中，糞便菌群還受小腸SIBO影響；(3)多種混雜因素導致微生物群落變異。成年人的胃腸道處于一種不斷重塑的狀態，這是基于年齡、性別、遺傳組成(腸道微生物群是可遺傳的)、環境、飲食、生活習慣、客觀和主觀的相互作用、急性和慢性疾病狀況以及受試者體內的空間差異等[3]。環境因素、飲食習慣、藥物或毒物是影響腸道菌群構成的最重要因素，遺傳、腸道運動障礙、代謝壓力、胃酸降低(SAH患者比其他患者接受更多的抑酸劑)、膽汁減少和免疫異常等，直接或間接影響腸道微生物組成[6]。特別是住院患者的飲食結構單一，通常缺乏可發酵的可溶性膳食纖維，或者患者可能由于各種原因限制飲食，也是導致腸道微生物組(如產生SCFA的細菌)的異質性和功能基因組學不穩定、SCFA水平變化的常見原因[7]；(4)SAH患者比其他患者接受更多的抗生素，當糞便微生物組成發生變化時，其他代謝物或代謝途徑也可能隨之改變。目前的研究并未涵蓋細菌以外的微生物，如真菌和病毒等，后者可以直接影響宿主與細菌之間的相互作用，真菌可以影響ALD患者的疾病進展、發病機制和臨床結局[9]。但對腸道細菌基因組學和代謝組學的影響所知甚少； (5)元基因組學能夠推斷微生物類群變化的功能后果，而不能直接確定不同微生物群的功能。然而，由于糞便中的RNA酶的差異，評估糞便中微生物轉錄組的能力更具挑戰性。應用可靠方法來測定糞便中微生物基因的表達以及與糞便和尿液中代謝物譜的聯系，用于了解它們在疾病的發生過程中的角色。

盡管存在這些局限性，該研究的發現為AH的腸道微生物群特征提供了新的見解，為ALD發病機制的研究和有針對性的干預措施奠定了微生物理論基礎。

五、未來研究方向

糞便微生物群的組成和代謝被視為腸道微生態系統動態變化過程的縮影。隨著時間的推移和宿主生活方式的改變而持續變化。未來研究應著眼于縱向的方法學設計，以解釋可能或目前正在影響腸道微生物群和ALD程度的混雜因素，利用這些信息制定新的預防和治療策略[7]。

總之，本文提供了酒精引起的糞便微生物群變化與日益嚴重的AH相關的額外變化的新信息。提供了關于糞便微生物組與疾病進展關系的見解，從而更全面地理解糞便微生物組在AH中的作用和探討未來AH的治療新靶點。