系統生物學方法研究非酒精性脂肪性肝病的基因通路

靳睿 饒慧瑛

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球常見的慢性肝臟疾病[1]。在過去的20年里，人們逐漸意識到了遺傳因素在NAFLD這種多因素疾病的病因和病程中的作用。研究者通過嚴格的患者篩選(從家庭和雙胞胎研究中得知的表型變異)、全基因組關聯研究(GWAS)和外顯子測序等，已在NAFLD的遺傳特點研究方面取得重大進展。

早期來自美國不同中心的回顧性研究報道了家族間表型聚集現象，其中受累成員表現出嚴重的NAFLD疾病特征，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化[2]。一項橫斷面研究顯示，NAFLD相關肝硬化患者的先證者(17.9%)出現晚期纖維化的比率是同齡對照組一級親屬(1.4%)的12倍[3]。表明遺傳因素在NAFLD病因和進展中都起著重要作用。由于NAFLD的復雜特征是宿主遺傳和環境因素相互作用的結果，要想全面了解NAFLD發生涉及的遺傳通路,需要將各種性狀與環境因素及其他可能與NAFLD特征具有協同作用的疾病綜合考慮。與肝臟脂肪變性相關的遺傳性疾病囊括了132個基因，其中32個與NAFLD的發病機制相關。現介紹調節脂滴(LD)生物學合成、脂肪從頭合成和脂肪酸區室化以及極低密度脂蛋白(VLDL)的組裝和分泌的途徑和遺傳變異。這些變異在NAFLD發病機制中的因果關系已通過功能研究和臨床隊列的廣泛研究得到驗證[4]。

一、遺傳變異在LD代謝途徑中的作用

(一)PNPLA3 rs738409C>G單核苷酸多態性(SNP)編碼Patatin樣磷脂酶結構域3(PNPLA3)的I148M蛋白變體，在所有人群中占NAFLD遺傳易感性的比例最大，同時也解釋了種族間疾病易感性的差異[5]。PNPLA3 I148M變體增加了與NAFLD相關的進行性肝損傷易感性，并且是肝病進展的一個常見的修飾因子[6-7]。PNPLA3對甘油三酯、磷脂和視黃酯存在固有的脂肪酶活性，可介導油酸和其他不飽和脂肪酸(包括花生四烯酸)的水解。當野生型蛋白質被迅速降解時，突變蛋白不能泛素化，可在LD表面聚集，同時改變核心脂質的重塑和周轉[8]。突變體I148M蛋白作為共顯性負基因發揮作用，導致LD水解受損[9]。此外，表達突變體PNPLA3的肝細胞表現出自噬功能缺陷和脂肪吞噬能力降低。這些缺陷可促進脂肪變性、乳酸堆積和NAFLD發生[9]。I148M突變體在降低肝星狀細胞釋放視黃醇的同時，也降低了LD的豐度，兩者結合促進星狀細胞活化，導致炎癥、纖維化和癌變。I148M突變體也可能改變脂肪細胞的脂質代謝和脂肪因子的分泌，進而影響肝臟的表型[10]。

(二)溶酶體酸性脂肪酶(LAL) 由LIPA基因突變導致的LAL亞型與溶酶體LD轉換缺陷和早期中性脂質儲存缺陷有關，由于溶酶體水解缺陷和LD自噬功能受損，促進肝臟膽固醇酯和甘油三酯積累，出現嚴重的NAFLD表型[11]。然而，目前尚不清楚雜合子LIPA攜帶者是否有成人NAFLD的風險。早期研究表明攜帶者患病率為1∶40 000，而最近對120個已知變體的調查發現其發病率<1∶175 000，表明LAL-D是導致NAFLD的次要原因[12]。

(三)HSD17B13 HSD17B13的最新進展進一步說明了LD重塑在修飾NAFLD表型中的重要作用。在代謝功能障礙或酒精濫用失調的情況下，編碼位于肝細胞LDs上的17-β羥類固醇脫氫酶13(HSD17B13)變異與遏制肝炎和纖維進展有關[13-14]。HSD17B13突變減輕肝損傷的主要機制與改變肝臟脂肪變性本身無關，但可能反映了視網膜醇代謝的改變以及纖維化和炎癥途徑的激活，盡管細胞特異性途徑(巨噬細胞、星狀細胞、肝細胞)尚待闡明[14]。現有的信息表明,HSD17B13的治療靶點可作為緩解NAFLD進展的一種策略。

二、遺傳變異在脂肪從頭合成、脂肪酸的分隔化通路中的作用

脂肪酸(FA)區隔化用來反映底物在多個途徑上的流動，包括FA攝取、脂肪從頭合成中的FA流量以及FA在LD水解和重塑過程中的再利用。遺傳學證據表明,脂質合成途徑與NAFLD的發病機制有關，包括葡萄糖激酶調節因子(GCKR)表達變異[15]。GCKR通過調節葡萄糖流入肝細胞的量從而調節脂肪生成底物的流動來調節脂肪從頭合成。大多數研究都指向一個共同的SNP(rs1260326)，它能編碼P446L變異，是與脂肪肝相關的變異。這種氨基酸替換削弱了GCKR對果糖-6-磷酸的反應從而抑制葡萄糖激酶，反映了控制肝臟葡萄糖攝取的負反饋回路[16]。攜帶P446L-GCKR突變體的受試者伴有循環中血糖降低和胰島素敏感性增高，但同時P446L變異體增加了肝臟丙二酰輔酶a的生成，它作為脂肪從頭合成的底物以及阻斷脂肪酸氧化促進肝臟甘油三酯的累積，從而促進肝臟脂肪變性[16]。

蛋白磷酸酶1調節亞基3B(PPP1R3B)位點基因變異也被認為可以防止肝臟脂肪堆積，該機制可能是PPP1R3B表達增加導致過多能量底物向糖原代謝而非脂質合成[17]。對脂質重塑在肝病發病機制中的重要認知來自全基因組關聯研究(GWAS)，該研究評估了歐洲隊列中對酒精相關性肝硬化的易感性，強調了一種接近膜結合O-酰基轉移酶結構域7(MBOAT7)位點變異的相關性[7]。MBOAT7表達受損會導致肝細胞和循環中含有花生四烯酸的磷脂酰肌醇水平降低，且越來越多的證據表明，其表達下調與肥胖和胰島素抵抗時NAFLD的發生有關，并反映了肝細胞脂滴中磷脂重塑的改變，特別是溶血磷脂酰肌醇脂質[7]。

三、遺傳變異在極低密度脂蛋白(VLDL)組裝和分泌途徑中的作用

肝臟脂質輸出在很大程度上取決于脂蛋白的組裝和分泌，該過程從內質網(ER)開始，然后將LDs從內質網膜轉移到ER內腔中。此初始步驟需要腔內轉移蛋白、微粒體甘油三酸酯轉移蛋白(MTTP)和受體蛋白、載脂蛋白B(APOB)，其突變或缺失可破壞VLDL組裝并導致肝脂肪變性，且伴隨血漿中膽固醇和甘油三酸酯的含量顯著降低。 APOB和MTTP中的遺傳變異分別導致常染色體顯性家族性低血脂蛋白血癥和常染色體隱性無β-脂蛋白血癥，其代表了NAFLD、肝硬化和肝細胞癌(HCC)的罕見遺傳原因[18]。2014年三個研究小組同時發現了與VLDL組裝和分泌缺陷相關的導致肝脂肪變性和NAFLD的另一種遺傳原因，即TM6SF2變異。 患有rs58542926突變體TM6SF2(E167K)的受試者表現出等位基因功能缺失，導致VLDL分泌缺陷、LDL水平降低、肝脂肪變性和纖維化[19]。但在整體TM6SF2基因敲除小鼠模型中，VLDL分泌的機制研究結果不一致，其中一些研究顯示肝脂肪變性和VLDL分泌減少，而其他研究則表明肝脂質無變化且血清甘油三酯水平無法解釋的升高[19-20]。矛盾的是， TM6SF2過表達增加了小鼠的肝脂質含量并降低了VLDL分泌。這些研究結果的差異反映了現在迫切需要了解Tm6sf2在VLDL分泌和肝臟損傷中的作用[20]。

四、系統生物學方法解釋NAFLD的發病機制

在NAFLD中指定單一機制和(或)單一基因/蛋白質的概念(如上所述)已演變成使用系統生物學方法探索多種因果相互作用的概念。NAFLD代表一系列組織學表型，具有顯著個體差異，與代謝綜合征重疊，與其他疾病(肥胖、2型糖尿病)以及多種癌癥具有(基因)多效性。有研究通過無偏倚的方法來探討涵蓋數千種蛋白質的多種通路和穩態相互作用，這一過程被稱為NAFLD- Reactome[21]。其研究結果涵蓋了11種NAFLD-Reactome途徑，包括小分子的運輸-特別是“血漿脂蛋白的組裝、重塑和清除”，新陳代謝以及子途徑“能量代謝的整合”，“脂質代謝”，“檸檬酸(TCA)循環和呼吸電子運輸”，通過子途徑富集的信號轉導“通過受體酪氨酸激酶進行信號傳遞”，通過子途徑富集的免疫系統“先天免疫系統”和“細胞因子”系統中的“信號轉導”，翻譯后修飾富集的蛋白質代謝和“β細胞發育的調控”。在11種NAFLD-Reactome途徑中，有8種從原始種子列表中確認了> 100個的術語，包括脂質代謝，免疫系統中的細胞因子信號傳導，信號轉導和蛋白質代謝。這些發現補充并擴展了以上總結的遺傳證據，并提示NAFLD脂質代謝改變的其他廣泛影響，包括巨噬細胞，星狀細胞信號傳導。其研究結果顯示,新陳代謝節點(R-HSA-1430728.8)產生的項數最多，其次是信號轉導和免疫系統。以代謝為代表的大節點還富含“檸檬酸/三羧酸(TCA)循環和呼吸電子傳遞”等亞途徑，其中包括線粒體轉運載體家族的成員，如解偶聯蛋白，參與產熱、脂肪酸代謝，與NAFLD相關的共病包括肥胖、糖尿病和退行性疾病。TCA循環和電子傳遞鏈產生的化學滲透梯度放松調節可能對NAFLD的發展和嚴重程度至關重要[22]。

網絡分析預測了免疫系統的一個節點，其子通路包括Toll樣受體的調節和糖基化終產物受體信號傳導，與糖尿病、動脈粥樣硬化、腎功能衰竭和衰老有關。同樣，作為主要囊泡介導轉運節點的一部分，B類受體亞途徑的清除作用被過度強調，宿主-病原體相互作用和病原體相關分子模式在NAFLD病理生理學以及代謝功能和能量平衡調節中發揮重要作用。Runt相關轉錄因子3(RUNX3)的研究結果引起了人們的興趣，因發現NASH患者肝臟RUNX3表達下調，而酒精性脂肪性肝炎(NASH)中則未見下調，這是鑒別NAFLD和酒精相關性脂肪肝的一個潛在鑒別指標[21]。與調節β細胞發育相關的通路與NAFLD高度相關，尤其是β細胞基因表達的調節和AKT介導的FOXO1(也稱為FOXO1A)失活有關。先前的研究表明，FoxO1(FoxO1的小鼠同源物)調節肝臟的多種代謝功能，包括糖異生、糖酵解和成脂基因表達途徑[23]。NAFLD-Reactome途徑證實了與遺傳性疾病相關的肝脂肪變性相關的基因的作用。這些發現強調了NAFLD通路分析的實用性，并為遺傳性疾病在確定因果變體和潛在藥理學目標中的作用提供了重要的新見解。

綜上所述，使用分子網絡推斷NAFLD發病機制的途徑存在一些局限，主要是因為預測的路徑是使用Pubmed中的現有數據構建，方法需要實驗驗證。雖然多組學技術的可用數據支持主要結論，但預測路徑的層次結構也需要正式的實驗驗證。然而，盡管存在數據挖掘的潛在限制，預測的NAFLD-Reactome通路為NAFLD的發展及其進展到纖維化和HCC段提供了重要的新線索和見解。