外泌體提取方法及其miRNA在非小細胞肺癌中的應用*

吳 靜 綜述，沈佐君 審校

(安徽醫科大學附屬省立醫院臨床檢驗中心，安徽合肥 230001)

細胞外囊泡是所有細胞主動分泌的納米級囊泡，活細胞釋放不同類型的細胞外囊泡進入細胞外環境進行細胞間交流，細胞外囊泡越來越多地被認為是有希望的液體活檢生物學標志物[1]。根據相似囊泡的直徑大小可將細胞外囊泡分為三類，直徑在50～150 nm的外泌體，直徑在100～1 000 nm的微囊泡、外粒體和微顆粒，直徑在100～5 000 nm的凋亡小體[2]。目前主要認為，外泌體產生的過程是細胞膜內陷形成內體，再形成多泡體，多泡體與質膜融合導致其管腔內囊泡釋放到細胞外，產生一種稱為外泌體的EV亞型。

1 外泌體的生物學特性

在透射電鏡下可以觀察到外泌體呈茶托型或一側凹陷的半球形，由脂質雙分子層包裹。外泌體是一種富含脂質的囊泡，含有豐富蛋白質及DNA和RNA片段(mRNA、miRNA和其他非編碼RNA)，CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP70等可作為外泌體的標志性蛋白，可用于外泌體的提取和鑒定。有研究認為，miRNA僅在其起源細胞的細胞內起作用[3]，ZHENG等[4]的研究表明，在他們的測序研究中檢測到的外泌體miRNA不僅可以作為潛在的生物診斷標志物，還可以被鑒定為潛在的抗癌藥物靶標。

外泌體的有效提取是進行實驗研究的第一步，本綜述旨在全面概述外泌體的提取方法及外泌體miRNA在非小細胞肺癌(NSCLC)中的應用。目前已經開發了多種不同的分離和富集方法，包括超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、沉淀法、試劑盒法、尺寸排阻法(SEC)、超濾法、基于表面成分親和力分離法、交流電動力學(ACE)分離法及微流控芯片法。

2 外泌體的提取純化方法

2.1基于密度的分離方法

2.1.1超速離心法 超速離心法是最常用的外泌體提取方法[5]，首先，施加較低速度的離心力300 g以從細胞培養液中去除細胞；然后，對上清液施加較大的離心力(10 000～20 000 g)，去除大的細胞碎片和破碎的細胞器；最后，再次進行高速(100 000～150 000 g)離心從上清液中收集外泌體，所有離心在4 ℃下進行[6]。超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染，且分離數量多，處理樣本小。盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的“金標準”，但仍然有很多缺點，如所需的超高速離心儀器比較昂貴、樣品量大、耗時長、電鏡觀察外泌體時仍存在蛋白質污染。

2.1.2蔗糖密度梯度離心法 目前已發現，外泌體在蔗糖梯度為1.15～1.19 g/mL密度中漂浮[7]，所以根據這個特性，可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心，外泌體沉降到不同的密度區域就可以將其區分出來。蔗糖密度梯度離心法需要預先配好連續梯度濃度的蔗糖溶液，將蔗糖溶液鋪于離心管底部，再將樣本放于上部，4 ℃下100 000 g超速離心。蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高，但是前期準備復雜，耗時長，又不能完全將外泌體與蛋白質分離開。2013年10月ISEV會議一些研究人員表示，通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時，細胞囊泡的生物功能喪失。

2.2沉淀法

2.2.1聚乙二醇(PEG) PEG是一種水溶性非離子化合物，具有極強的親水性，可以與疏水的脂質雙分子層結合，從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉淀。RIDER等[7]研究發現，PEG水平會影響外泌體的產率，且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數量和質量上足以用于蛋白質組學和測序分析。沉淀法操作簡單，不需要特殊設備，更經濟，外泌體產量高，但是會沉淀一些非外泌體的疏水性物質而導致外泌體純度不夠。

2.2.2試劑盒法 最近已經開發出基于聚合物共沉淀的試劑盒，如ExoQuick、TEI等，可用于提取多種體液中的外泌體。聚合物沉淀劑ExoQuick與樣品4 ℃共孵育30 min，然后室溫1 500 g離心30 min，即可獲得外泌體沉淀。與超速離心法比較，試劑盒法更簡便、耗時短，且能獲得更高的外泌體產量[8]。試劑盒法獲得外泌體沉淀含有的雜質較多，不同來源的樣本需要使用不同的試劑盒來進行提取，且試劑盒價格較貴。

2.3基于大小的分離方法

2.3.1SEC SEC主要根據外泌體的大小對外泌體進行分離和純化。樣品中大分子物質不能進入凝膠孔而被流動相快速洗脫出來，尺寸小于孔徑的物質可進入多孔材料，需要較長時間被洗脫出來，即可通過不同的洗脫時間分離外泌體。B?ING等[9]證明了瓊脂糖凝膠可以從無血小板上清液中純化出外泌體，通過這種方法，外泌體很容易從蛋白質和高密度脂蛋白中分離出來。HONG等[10]通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體，與漫長而復雜的超速離心法不同，它可在30 min內完成外泌體分離。通過SEC分離得到的外泌體純度較高，分離出結構上完整且功能活躍的囊泡是基于微型SEC分離的重要優勢，但數量較少，而且需要特殊設備，故應用不廣泛。

2.3.2超濾法 超濾法是根據外泌體的大小使用相應孔徑的濾膜，將樣品中小分子物質過濾到膜的另一側，而將大分子物質滯留在膜上來達到分離的目的。超慮法簡單、省時、成本低。LIU等[11]改良了簡單的超濾法，通過將不同孔徑的膜(200、100、80、50、30 nm)串聯在一起，實現了不同大小外泌體的快速分離，且捕獲效率明顯高于超速離心法。然而，過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質堵塞，這種情況很容易導致膜壓力過大而破碎。

2.4基于表面成分親和力的分離法

2.4.1蛋白質 外泌體表面含有豐富的蛋白質，所以基于其表面成分的親和力特別適合于分離外泌體。CD63是外泌體中發現的最豐富的蛋白質之一，因此，常用抗CD63免疫吸附外泌體。ZHAO等[12]通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合，將外泌體捕獲到磁珠上后，加緩沖液沖洗5 min，然后引入3種不同熒光染料標記的抗體[抗CD24、抗上皮細胞黏附分子(抗EpCAM)、抗糖類抗原-125(抗CA-125)]，通過觀察不同熒光強度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標志物的表達水平。

2.4.2膜磷脂 雖然大部分基于表面成分的親和方法是基于外泌體表面的蛋白質，但是脂質雙層也是一種很好的檢測目標。XU等[13]利用外泌體膜上表達的磷脂酰絲氨酸(PS)可以被PS結合受體Tim4很好地結合，用Tim4固定化的磁珠與樣品反應進行外泌體捕獲，并且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態，與商業外泌體提取試劑盒相比，表現出更高的捕獲率。CHEN等[14]利用外泌體將帶負電荷的PS暴露在膜上的特點，使用帶正電荷基團的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應，血漿中的外泌體就能與磁珠結合，通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質蛋白。

2.5ACE分離法 ACE微陣列產生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場產生的，納米級的粒子和其他納米級實體物質被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場區域，細胞和大的實體物質被吸引到DEP低場區域。IBSEN等[15]的ACE裝置需要30～50 μL血漿樣品就能夠在15 min內將外泌體濃縮到微電極周圍的高場區域。ACE設備流程明顯快于目前使用的方法，這個裝置簡化了外泌體提取和回收過程的能力，明顯減少了加工步驟和消耗時間。CHEN等[16]構建了具有交叉電極的DEP芯片，能在30 min內從血漿樣品中分離出外泌體。經過測試證明，DEP芯片具有高捕獲率和高回收率，需要的時間更短，并且不需要笨重和貴重的儀器。

2.6微流控芯片法 微流控芯片法是新開發出來的用于快速高效分離樣品中外泌體的方法。WOO等[17]使用2個納米過濾器(Exodisc)集成的實驗盤在30 min內實現了20～600 nm外泌體的全自動富集。使用納米粒子跟蹤分析定量檢測證實了細胞培養上清液中外泌體的回收率大于95%。與超速離心法相比，Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平，更省時，所需樣本量更少。FANG等[18]開發了一種微流體芯片，將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入芯片，在第1個腔室中捕獲到外泌體，通入一抗與磁珠-外泌體混合物結合，再通入熒光標記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個腔室。微流控芯片法操作簡單，捕獲率高，特別適合于生物學研究。

外泌體作為癌癥診斷的有前景的生物學標志物，其在癌癥的液體活檢中受到關注。外泌體的生物學價值和臨床應用價值凸顯了開發有效提取和分離外泌體技術的重要性和必要性。相信隨著技術的不斷進步和創新，外泌體提取將變得更加簡便經濟，純度越來越高，完整性越來越好。

3 外泌體的應用

外泌體廣泛存在于血液、唾液、尿液、母乳和腹水等體液中[19]，可以方便獲得。與健康對照組比較，癌癥患者外周血中具有更高水平的外泌體[20]，肺癌細胞分化的外泌體對于診斷肺癌有重要臨床意義。肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中NSCLC占所有類型肺癌的85%以上，具有易轉移、易復發、惡性程度高等特點，生存率較低。目前仍然缺乏精準的早期篩查方法，因此，有必要尋找靈敏度和特異度更高的早期檢測的分子標志物。

3.1外泌體miRNA在NSCLC中的作用 miRNA被定義為一種小非編碼RNA，在基因表達的轉錄后調控中起關鍵作用。miRNA越來越被認為是潛在的疾病非侵入性生物學診斷標志物，有越來越多的證據表明，miRNA表達失調與NSCLC的發生和發展相關[21-22]。RODRGUEZ等[23]的實驗數據表明，與非腫瘤患者血漿外泌體中檢測到的miRNA比較，在NSCLC患者的血漿外泌體中檢測到更多具有高表達的miRNA。ZHOU等[24]通過系統搜索PubMed、Web of Science和Embase進行研究，強調外泌體衍生的miRNA可以用作NSCLC患者的潛在診斷和治療生物學標志物。

3.2外泌體miRNA在NSCLC中的診斷 外泌體miRNA可能成為篩選、診斷、檢測癌癥的有效生物標志物。GIALLOMBARDO等[25]通過聚合酶鏈反應檢測8種miRNA(miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221和miR-222)與NSCLC相關，并且推斷從這些上調或下調的miRNA中能發現NSCLC的外泌體生物學標志物。MUNAGALA等[26]研究發現，miR-21和miR-155在復發肺癌中的表達明顯增高，表明外泌體miRNA在區分復發性肺癌和原發性肺癌中起重要作用。JIN等[27]通過分離NSCLC患者血漿中腫瘤來源的外泌體，與健康個體來源的外泌體進行miRNA測序，并對其診斷準確性進行驗證發現，腺癌特異性的miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p及鱗狀細胞癌特異性的miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b可用于早期NSCLC的診斷，是非侵入性生物學標志物的有效候選者。

外泌體作為一種生物載體，分布廣泛，可用于無創性診斷，包含蛋白質、核酸等生物信號，可在細胞之間傳遞生物信息和物質交換。外泌體囊泡結構穩定，可有效保護miRNA免受RNase降解，使外泌體內的miRNA更穩定、豐度更高。外泌體在肺癌治療過程中會逐步提高其診斷的精確性和準確性，能夠盡早發現肺癌，并及時進行治療，提高患者的生存率。

4 外泌體提取面臨的挑戰及展望

近十年來，人們越來越認識到外泌體的重要作用。盡管人們對這一領域的興趣日益濃厚，但是如何提高外泌體的產量和純度是目前面臨的一大挑戰。雖然國內外學者嘗試不同的分離純化方法，取得了一定進展，但成本和效率仍然是限制外泌體研究和應用的關鍵。因此，建立可靠的外泌體提取方法，有助于外泌體在臨床上的應用。本文主要介紹了幾種不同外泌體的分離提取方法及其在NSCLC中的作用。隨著醫療技術的發展和創新，外泌體還有很多需要探索的地方，相信外泌體在肺癌的診斷和治療應用上將會有更廣闊的前景。