凍融移植胚胎培養(yǎng)第7天囊胚成功獲得活產(chǎn)1例▲

阮秋燕 唐秀法 公方強(qiáng) 方偉芬 乃東紅 牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)計(jì)劃生育研究中心生殖醫(yī)學(xué)科，南寧市 530021，電子郵箱：qiuyanruan@163.com)

囊胚培養(yǎng)技術(shù)是目前評估胚胎發(fā)育潛能較為普遍的一種方法，胚胎在培養(yǎng)第5～7天能夠形成囊胚被視為具有較高的發(fā)育潛能[1]。發(fā)育緩慢被認(rèn)為是胚胎發(fā)育潛能低下的標(biāo)志之一，這可能是胚胎發(fā)育異常和非整倍體率高造成的，是胚胎植入失敗的危險(xiǎn)因素[2-3]。目前，大部分生殖中心(以下簡稱中心)常規(guī)選擇移植或冷凍胚胎培養(yǎng)后第5～6天的囊胚，丟棄在第6天仍未形成可用囊胚的胚胎，較少有中心觀察胚胎至第7天，第7天囊胚的臨床應(yīng)用價(jià)值還存在較大爭議。本文報(bào)告1例凍融移植胚胎培養(yǎng)第7天囊胚獲得活產(chǎn)的病例，旨在為胚胎發(fā)育緩慢、在第5～6天未獲得可移植胚胎的病例提供參考。

1 資料資料

1.1 一般資料及病史 女方32歲，男方34歲，婚后10年未孕，因女方“盆腔炎性疾病后遺癥”于2017年3月在我院行輔助生殖技術(shù)助孕。女方體重指數(shù)26.22 kg/m2，平素身體健康，月經(jīng)規(guī)律，B超監(jiān)測排卵提示正常，基礎(chǔ)性激素檢查正常。男方平素身體健康，無煙酒嗜好，否認(rèn)腮腺炎、不潔性生活等病史。男方多次行精液常規(guī)分析結(jié)果均提示為中度弱精子癥，正常形態(tài)精子比例為4%；查性激素正常，染色體核型分析為46,XY。曾于2017年3月在我院行第1周期體外受精胚胎移植術(shù)助孕，采用拮抗劑方案進(jìn)行降調(diào)，獲得卵丘-卵子復(fù)合物4枚，其中第二次減數(shù)分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)的卵母細(xì)胞(即成熟卵母細(xì)胞)3枚；術(shù)日精子質(zhì)量差，行單精子卵胞漿注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后獲得正常受精胚胎[即2個原核 (2 pronucleus,2PN)胚胎]3枚，正常卵裂胚胎3枚，優(yōu)質(zhì)胚胎1枚(6細(xì)胞2級胚胎，6CG2)，2枚非優(yōu)質(zhì)胚胎(1枚4細(xì)胞1級胚胎4CG1，1枚因質(zhì)量差經(jīng)醫(yī)學(xué)處理后廢棄)；移植新鮮第3天胚胎2枚(6CG2，4CG1)，未孕。無冷凍胚胎。

1.2 卵子采集和精液分析 2017年8月28日在我院行第2次助孕治療，采用黃體期短效促性腺激素釋放激素激動劑長方案進(jìn)行降調(diào)，采用重組人促卵泡激素聯(lián)合重組人絨毛膜促性腺激素進(jìn)行促排卵。2017年9月22日在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺獲取卵丘-卵子復(fù)合物12枚，其中10枚MⅡ卵子用于ICSI。男方禁欲4 d后采用手淫法獲得精液用于ICSI，經(jīng)過精液分析，精液體積3.5 mL，呈灰白色，濃度5×106/mL，活動率為11%，前向運(yùn)動精子率為3%。

1.3 胚胎觀察 ICSI后18 h觀察胚胎受精情況。 2PN胚胎視為正常受精胚胎；第3天卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)≥6個，卵裂球大小均一、碎片比例≤20%、胞質(zhì)飽滿、質(zhì)地均勻的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；第3天優(yōu)質(zhì)胚胎大于5枚，則進(jìn)行全囊胚培養(yǎng)；囊胚評分采用 Gardner評分系統(tǒng)，發(fā)育到3BC及以上的胚胎予以移植或冷凍。患者ICSI后第1天獲得10枚2PN胚胎，第3天獲得9枚優(yōu)質(zhì)胚胎(包括10細(xì)胞2級胚胎10CG2 1枚，7細(xì)胞1級胚胎7CG1 1枚，7細(xì)胞2級胚胎7CG2 3枚，6細(xì)胞2級胚胎6CG2 4枚)和1枚非優(yōu)質(zhì)胚胎(4細(xì)胞2級胚胎4CG2);將全部胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后第5天胚胎為卵裂期樣胚胎，第6天形成2枚融合期胚胎，將胚胎培養(yǎng)至第7天，2枚融合期胚胎發(fā)育成2枚3BC囊胚。因女方內(nèi)膜未準(zhǔn)備好，采用日本加藤玻璃化冷凍復(fù)蘇試劑及載體(Kitazato公司，試劑編號為 VT101 /102 ，載體為CryoTop)對胚胎進(jìn)行冷凍，按照說明書嚴(yán)格操作。

1.4 解凍移植 月經(jīng)周期第4天開始采用B超監(jiān)測內(nèi)膜，口服戊酸雌二醇片(廣州先靈藥業(yè)有限公司，批號：B14202007142)1.5 mg/次，2次/d，8 d后增至6 mg/d；第15天開始口服地屈孕酮(荷蘭Abbott Healthcare Products B.V.，批號：C14202012256)20 mg/次，3次/d進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第6天，即2018年5月22日，進(jìn)行解凍胚胎移植。采用日本加藤玻璃化冷凍復(fù)蘇試劑及載體進(jìn)行胚胎復(fù)蘇，按照說明書嚴(yán)格操作。解凍完成后對囊胚進(jìn)行輔助孵化，短暫培養(yǎng)后進(jìn)行移植。共解凍2枚第7天囊胚，均成活，短暫培養(yǎng)后囊胚長勢良好，移植時均成功擴(kuò)張孵出(5BC)，移植過程順利。移植后按上述劑量持續(xù)使用戊酸雌二醇片和地屈孕酮，2周后查血人絨毛膜促性腺激素水平為1 663 mIU/mL，并繼續(xù)支持持續(xù)妊娠到第10周；在28 d后采用B超檢測孕囊和胎心，監(jiān)測到2個孕囊，內(nèi)見胎芽、卵黃囊及原始心血管搏動，獲得雙胎妊娠。孕36+2周行剖宮產(chǎn)獲得活產(chǎn)一男嬰(2.8 kg)和一女嬰(2.3 kg)，出生后10 min Apgar評分10分，外觀無異常。

2 討 論

目前，有學(xué)者通過Time-lapse培養(yǎng)系統(tǒng)觀察胚胎發(fā)育動力學(xué)參數(shù)并結(jié)合妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn)，胚胎在受精后卵裂到8細(xì)胞的時間(t 8)能較好預(yù)測胚胎種植結(jié)局[4]，其中t 8>68 h是胚胎植入失敗的危險(xiǎn)因素[5]。本例患者第1周期ICSI后僅獲得3枚正常受精胚胎，其中有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎(6CG2)；第2周期ICSI第3天獲得9枚優(yōu)質(zhì)胚胎，但僅有1枚胚胎大于8細(xì)胞。由此提示該患者整體胚胎發(fā)育較慢，胚胎發(fā)育速度異常與子宮植入窗不吻合可能是患者多年不孕的原因。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，約67%的囊胚在胚胎培養(yǎng)后第5～6天形成，約29%的囊胚在第7天形成[2]；第5、6、7天囊胚的可用囊胚率分別為65%、30%、5%[6]。約3%的患者僅在培養(yǎng)第7天形成可用囊胚[6]，移植后能夠獲得16.6%～31.7%的臨床妊娠率和25%的活產(chǎn)率，與第6天囊胚的臨床結(jié)局相似，但顯著低于第6天囊胚[1-2,7-8]。Utsunomiya等[9]報(bào)告第7天囊胚的臨床妊娠率小于10%；而Whitney等[10]報(bào)告第7天囊胚流產(chǎn)率高于第5天囊胚，活產(chǎn)率低于第5天囊胚。而非整倍體率高可能是造成第7天囊胚臨床妊娠率低、流產(chǎn)率高(與在第5～6天囊胚相比)的重要原因。植入前胚胎遺傳學(xué)非整倍體檢測(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)是目前檢測早期胚胎非整倍體的有效方法之一，能有效降低非整倍體移植率而提高胚胎植入率，并減少異常胚胎植入給患者帶來的痛苦[11-12]。Hernandez-Nieto等[13]通過PGT-A分析不同天數(shù)囊胚，發(fā)現(xiàn)胚胎非整倍體率隨著形成囊胚天數(shù)的增加而增加，并發(fā)現(xiàn)整倍體單胚胎解凍移植臨床妊娠率隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而顯著下降，這可能是第7天囊胚質(zhì)量差造成的。

本例患者第2周期助孕治療時，將全部胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后，第5天胚胎呈卵裂期樣，第6天形成2枚融合期胚胎，培養(yǎng)至第7天才形成2枚3BC囊胚，進(jìn)行胚胎冷凍，女方內(nèi)膜準(zhǔn)備好后，經(jīng)胚胎復(fù)蘇，順利移植，最終成功獲雙胎妊娠，母嬰結(jié)局均良好。但是目前，第7天囊胚發(fā)育遲緩、胚胎質(zhì)量差和非整倍體率高使其臨床應(yīng)用的可行性和安全性存在較大爭議[7]。對于該部分患者，在第3、5、6天沒有獲得可移植胚胎，未見明顯細(xì)胞退化的情況下，將胚胎延長培養(yǎng)至第7天可能是一種無奈的選擇，若形成可用囊胚建議結(jié)合PGT-A技術(shù)，移植整倍體囊胚可以改善妊娠結(jié)局，在一定程度上減少患者精神上和經(jīng)濟(jì)上的壓力，減少患者多次刺激卵巢進(jìn)行取卵的痛苦，提高累計(jì)妊娠率。尋找患者因素、優(yōu)化培養(yǎng)條件、改善發(fā)育遲緩胚胎的發(fā)育速度和胚胎質(zhì)量，可能是進(jìn)一步的研究方向。

總之，由于目前第7天囊胚移植報(bào)道較少，第7天囊胚占總移植胚胎比例小，其應(yīng)用價(jià)值和安全性需要長期隨訪以及跟蹤后代健康來證實(shí)。