濕熱證候動(dòng)物模型研究述評(píng)

王瑤， 武曼麗， 鄭鋒玲， 劉珊， 駱歡歡

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 501405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)期刊中心，廣東廣州 510006）

濕熱證候在中醫(yī)臨床上較常見(jiàn)，且涉及的疾病譜也較廣泛，如感染性疾病、慢性代謝性疾病以及各系統(tǒng)疾病中均可出現(xiàn)濕熱證的病理改變。臨床研究表明，濕熱證常包括多個(gè)子證型，主要有脾胃濕熱、脾虛濕熱、下焦?jié)駸帷⒏文憹駸岬龋幌嚓P(guān)疾病分屬多個(gè)系統(tǒng)，以消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病最為多見(jiàn)[1]。濕熱證的臨床表現(xiàn)以身熱不揚(yáng)、胸脘痞悶、身重體倦、大便黏滯不爽、舌紅苔黃膩、脈象滑數(shù)為主癥，以病情纏綿難愈為顯著臨床特征。中醫(yī)病機(jī)學(xué)理論認(rèn)為，濕熱致病不離“濕熱膠著”和“內(nèi)外相引”。濕熱膠著，濕與熱易于合而為患，濕蘊(yùn)熱內(nèi)，熱處濕中，濕熱相合，如油入面，膠結(jié)難分，難于速去，致使病情復(fù)雜、病程遷延。嗜食肥甘厚味、飲酒無(wú)度等可致濕熱內(nèi)生，若外界環(huán)境濕熱氤氳，同氣感召，則內(nèi)外濕熱相加為害致使病情反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈。中醫(yī)臨床對(duì)濕熱證的治療頗感棘手，也嚴(yán)重影響了中醫(yī)對(duì)疾病的整體治療效果。

證候機(jī)理的研究是臨床療效提高的前提。深入闡釋濕熱證的證候本質(zhì)，對(duì)于濕熱致病條件下，如何做到既病防變，精準(zhǔn)治療，突破治療瓶頸，進(jìn)而提高病證整體療效具有重要的意義。近年來(lái)隨著對(duì)中醫(yī)濕熱證候研究的增多，中醫(yī)濕熱證動(dòng)物模型構(gòu)建方法也在不斷創(chuàng)新，研究結(jié)果部分反映了濕熱證候的特征及本質(zhì)，然而其模型構(gòu)建因素、成模標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)際運(yùn)用等均不能真正滿足基礎(chǔ)研究及臨床中醫(yī)現(xiàn)代化研究的需要。以下對(duì)近年來(lái)中醫(yī)濕熱證候的研究進(jìn)展進(jìn)行述評(píng)。

1 基于中醫(yī)病機(jī)學(xué)說(shuō)構(gòu)建濕熱證動(dòng)物模型概況

1.1 溫病濕熱證動(dòng)物模型清代醫(yī)家柯韻伯所述“實(shí)則陽(yáng)明，虛則太陰”，言簡(jiǎn)意賅地指出了外感溫病濕熱證的病機(jī)發(fā)展特點(diǎn)。基于此，有學(xué)者根據(jù)傳統(tǒng)溫病分類(lèi)方法分別制備溫病濕熱證濕重于熱、熱重于濕的模型，將“中氣實(shí)”“中氣虛”與“內(nèi)濕”“外濕”相互結(jié)合。

熱重于濕模型的建立通常采用人工氣候箱模擬外界濕熱環(huán)境，通過(guò)高脂高糖飼料模擬體內(nèi)濕熱環(huán)境，采用灌胃附子干姜煎劑或大黃附子湯煎劑、灌胃鼠傷寒沙門(mén)氏菌或大腸桿菌以造成脾虛等綜合方式。結(jié)果顯示此種熱重于濕大鼠模型，其胃動(dòng)素（MTL）和胃泌素（GAS）均較正常組降低，大鼠呈現(xiàn)體溫升高，飲水量、飲食量、小便量減少，大便黏滯，喜打斗、毛色暗黃無(wú)光澤等現(xiàn)象；血清蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)研究顯示，熱重于濕大鼠血清中可見(jiàn)12 個(gè)具有差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)[2-3]。

濕重于熱模型采用人工氣候箱模擬外界濕熱環(huán)境、高脂高糖飼料模擬體內(nèi)濕熱環(huán)境、灌胃大黃煎劑或小承氣湯、灌胃鼠傷寒沙門(mén)氏菌或不使用生物學(xué)因素等綜合因素建立。結(jié)果顯示此種濕重于熱組小鼠血清D-木糖、血清淀粉酶低于正常對(duì)照組，大鼠大便稀薄程度和小便量增多程度顯著高于熱重于濕組和正常對(duì)照組，濕重于熱組舌組織固有層炎癥、充血及水腫較濕熱并重組更顯著[4-5]。

濕熱并重模型采用人工氣候箱模擬外界濕熱環(huán)境、高脂高糖或高蛋白飼料模擬體內(nèi)濕熱環(huán)境、灌胃白酒模擬生活因素、灌胃鼠傷寒沙門(mén)氏菌或不使用生物學(xué)因素等綜合因素建立。結(jié)果顯示此種濕熱并重大鼠的MTL 水平明顯高于熱重于濕組，GAS 稍微高于熱重于濕組，小鼠存在腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，表現(xiàn)為大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬等條件致病菌過(guò)度增長(zhǎng)[3，6]。

1.2 臟腑病機(jī)濕熱證動(dòng)物模型薛生白《濕熱病篇》謂：“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱。”脾胃為后天之本、氣血生化之源，脾喜燥而惡濕，同氣感召，故濕熱常易傷脾。有學(xué)者根據(jù)脾胃濕熱證的病機(jī)以及臨床表現(xiàn)，研究?jī)?nèi)外因結(jié)合造模法，即濕熱環(huán)境加高脂高糖飲食加白酒或飲食失節(jié)的綜合造模方法，結(jié)果顯示此種脾胃濕熱模型大鼠飲食減少、精神萎靡、毛發(fā)疏松粗糙，大便時(shí)干時(shí)溏，血清GAS 水平升高，腸組織中MTL 水平也升高，胃竇處有明顯的潰瘍和糜爛[7-8]。韋嵩等[9]采用人工氣候箱、高脂高糖飲食、水楊酸鈉灌胃等方法構(gòu)建慢性胃炎脾胃濕熱證模型，結(jié)果顯示模型組大鼠飲食量、飲水量明顯較正常組降低，體質(zhì)量下降，水通道蛋白3（AQP3）、水通道蛋白4（AQP4）基因表達(dá)水平高于脾虛組。

中醫(yī)認(rèn)為，大腸為“傳道之官，變化出焉”。大腸濕熱證臨證常見(jiàn)“腹痛下痢，里急后重”。有學(xué)者采用高糖高脂飼料、人工氣候艙結(jié)合產(chǎn)毒性大腸桿菌灌胃造模，發(fā)現(xiàn)按此種方法建立的大腸濕熱模型大鼠可出現(xiàn)肛溫上升、肛門(mén)紅腫出血、食欲不振等癥狀，幾乎全部模型大鼠的腸管黏膜出現(xiàn)彌漫性充血、水腫，大量黏液和纖維蛋白滲出，病變主要見(jiàn)于十二指腸、空腸回腸、乙狀結(jié)腸、直腸；電鏡下可見(jiàn)腸組織細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞器腫脹，微絨毛稀疏變短[10-11]。也有學(xué)者采用以喂食肥甘及辛辣飼料、人工氣候箱為基礎(chǔ)，先后灌胃克林霉素磷酸酯及大腸桿菌的方法建立抗生素相關(guān)性大腸濕熱證大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、喜扎堆、攝食減少、被毛稀疏無(wú)光澤、大便黏膩、排便次數(shù)增加等表現(xiàn)[12]。除出現(xiàn)以上外觀表現(xiàn)外，模型大鼠還出現(xiàn)血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸含量升高，結(jié)腸組織過(guò)氧化物酶（MPO）含量升高，腸黏膜分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量降低，腸內(nèi)容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，而腸球菌、大腸桿菌顯著增加等表現(xiàn)[12]。

有學(xué)者先用異硫氫酸苯酯灌胃誘導(dǎo)大鼠肝損傷，之后以人工氣候艙、高脂高糖飲食構(gòu)建肝膽濕熱證膽汁淤積模型大鼠，結(jié)果顯示黃疸濕熱組模型大鼠體質(zhì)量下降明顯，肛溫升高顯著，血清膽紅素、膽汁酸水平升高顯著，并可見(jiàn)肝小葉欠完整，肝臟細(xì)胞腫脹變性，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死等肝內(nèi)膽汁淤積的病理特點(diǎn)[13-15]。也有學(xué)者[16]采用辛辣、油膩飼料喂養(yǎng)家兔構(gòu)建膽囊炎濕熱蘊(yùn)結(jié)動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶、膽囊黏膜粗糙等現(xiàn)象；光鏡下可見(jiàn)黏膜的膜上皮萎縮、肌層增厚，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞及滲出物。

2 濕熱證候動(dòng)物模型構(gòu)建現(xiàn)狀分析

2.1 構(gòu)建機(jī)理1988 年，郭金龍等[17]率先提出基于中醫(yī)學(xué)“外濕引動(dòng)內(nèi)濕”理論制備濕熱動(dòng)物模型，通過(guò)人工氣候艙模擬長(zhǎng)夏濕熱環(huán)境造成外濕，飼喂大鼠“豬脂加蜂蜜”損傷脾氣，使脾胃運(yùn)化失常造成內(nèi)濕；二者相互結(jié)合，制備濕熱證候模型。1990年，王新華[18]在之前濕熱證模型基礎(chǔ)上聯(lián)合大腸桿菌內(nèi)毒素的生物學(xué)因素建立濕熱證模型，其后吳仕九等[19]以濕熱證的發(fā)病機(jī)理、臨床表現(xiàn)以及西醫(yī)傳染病學(xué)為基礎(chǔ)，研究了6種不同的造模方法，最后認(rèn)為以飲食因素、氣候環(huán)境因素、鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染的綜合因素造模方法比較理想。

濕熱一證的致病機(jī)理始終不離飲食、環(huán)境、生物因素、疾病等，故其證候模型的構(gòu)建始終重視以上相關(guān)因素[20]。飲食因素的構(gòu)建常采用高脂、高糖飲食如“豬脂加蜂蜜”措施，或高蛋白飲食，此類(lèi)方法均符合中醫(yī)學(xué)理論，且能有效造成一定程度的代謝功能紊亂[17]。部分學(xué)者在造模中采取飲食失節(jié)的措施模擬脾胃損傷使脾失運(yùn)化，也符合“太陰內(nèi)傷”濕重于熱的中醫(yī)病機(jī)機(jī)理的。然而，大鼠、小鼠、兔等有著不同于靈長(zhǎng)類(lèi)的飲食結(jié)構(gòu)需求，且該“脾失運(yùn)化”未能有效通過(guò)客觀指標(biāo)證實(shí)。

對(duì)氣候環(huán)境因素的構(gòu)建方法，各位學(xué)者相對(duì)較為統(tǒng)一，多采用人工氣候艙構(gòu)建高溫高濕環(huán)境，但溫度、濕度沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。值得一提的是，人工氣候艙作為濕熱證構(gòu)建的重要工具，其性能穩(wěn)定性堪憂，亟待環(huán)境溫度濕度變動(dòng)小、顯示清晰、有一定通風(fēng)功能的改良人工氣候艙面世。

生物因素與疾病造模方法，其立意源于溫病濕熱證理論或疾病濕熱證理論，從而形成了疾病證候模型，然而如何評(píng)價(jià)疾病對(duì)證候的影響，是值得研究探索的關(guān)鍵問(wèn)題。另外，以多因素復(fù)合方式構(gòu)建的濕熱證候模型，因涉及施加因素太多，造成后期成模標(biāo)準(zhǔn)與因素分析的復(fù)雜化、不確定性。

2.2 模型動(dòng)物本研究以“濕熱，小鼠，模型”為關(guān)鍵詞在中國(guó)知網(wǎng)上搜索，顯示結(jié)果為91 條，在萬(wàn)方學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫(kù)上顯示結(jié)果為25 條；以“濕熱，大鼠，模型”為關(guān)鍵詞在中國(guó)知網(wǎng)上搜索，顯示結(jié)果為191條，在萬(wàn)方學(xué)位論文數(shù)據(jù)庫(kù)上顯示結(jié)果為147條；以“濕熱，兔”為關(guān)鍵詞搜索僅僅找到數(shù)篇相關(guān)文獻(xiàn)。可見(jiàn)目前濕熱證模型的造模動(dòng)物多以大鼠、小鼠為主。

中醫(yī)辨證診斷信息主要基于望、聞、問(wèn)、切四診。隨著近年來(lái)中醫(yī)現(xiàn)代化的進(jìn)程，中醫(yī)辨證診斷亦亟待客觀化指標(biāo)的補(bǔ)充與豐富，而證候動(dòng)物模型的發(fā)展遲緩大大限制了中醫(yī)證候客觀化研究。其中的制約因素之一即是大鼠、小鼠、兔等證候模型的構(gòu)建程度的不確定性，主要表現(xiàn)為上述動(dòng)物模型癥狀、體征、舌象、脈象的不確定性，使證候模型時(shí)常呈現(xiàn)說(shuō)服力不足的局面。

2.3 成模標(biāo)準(zhǔn)望、聞、問(wèn)、切四診是中醫(yī)辨證的主要信息采集方法，因此雖然造模方法多種多樣，但成模標(biāo)準(zhǔn)總離不開(kāi)臨床表現(xiàn)。濕熱證候模型多以觀察動(dòng)物的體質(zhì)量、背毛、活動(dòng)、飲食及飲水量、糞便等為主，而僅以此來(lái)判斷造模成功與否是缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性的；且以上變量指征的可控性和可重復(fù)性較差，也未能反映中醫(yī)診斷學(xué)中舌診、脈診的內(nèi)容。如在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠自身體溫變動(dòng)極大，不宜用于模擬溫病濕熱證的體溫改變。

隨著中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展，濕熱證候的生物學(xué)基礎(chǔ)也得到了廣泛而深入的研究，免疫炎癥、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、水通道蛋白等相關(guān)通路與濕熱證候模型均呈現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)，部分指標(biāo)甚至具有相對(duì)特異性，如脂多糖（LPS）、Toll 樣受體4（TLR4）、核因子κBp65（NF-κBp65）、水通道蛋白3（AQP3）等[21-24]。近年來(lái)，宏基因組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)快速發(fā)展，通過(guò)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證候的特異性生物標(biāo)志物的研究也受到了廣泛關(guān)注，濕熱證候模型成模標(biāo)準(zhǔn)的研究也出現(xiàn)了新的方向。有學(xué)者對(duì)濕熱證候模型小鼠的組學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示模型小鼠腸道菌群、血清蛋白質(zhì)組學(xué)出現(xiàn)了一些規(guī)律性的改變[25-26]。

3 濕熱證候模型構(gòu)建方法的改良思路

3.1 構(gòu)建機(jī)理的改良在既往眾多研究者對(duì)濕熱證候模型的探索、歸納、總結(jié)的基礎(chǔ)上，有研究者嘗試以高糖飲食、高脂飲食、高蛋白飲食，及濕熱環(huán)境等因素分別造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純的濕熱環(huán)境、單純的高脂飲食均能使小鼠呈現(xiàn)體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、背毛潮濕、陰囊下墜、大便黏滯等表現(xiàn)，并同時(shí)存在LPS、TLR4、AQP3 及舌、結(jié)腸HE 染色病理、腸道菌群的改變[25-26]，可部分解決復(fù)合因素造模可重復(fù)性差、不確定性大的弊端。

3.2 模型動(dòng)物的選擇為盡量模擬展示濕熱證候模型的四診資料如舌象、脈象等，可選擇一些比較接近人類(lèi)的生理特性的動(dòng)物，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物是目前較為合適的選擇。非人靈長(zhǎng)類(lèi)與人類(lèi)基因組序列具有高度的同源性，在生理結(jié)構(gòu)、代謝周期、行為方式等方面與人類(lèi)有高度相似性。如獼猴也有ABO 血型，雌性獼猴性周期為21 ～28 d，月經(jīng)周期2 ～3 d，這些都與人類(lèi)高度相似。作為世界范圍內(nèi)分布最廣的非人靈長(zhǎng)類(lèi)，獼猴屬（Macaca）物種是科學(xué)研究的重要模型動(dòng)物，特別是在生物醫(yī)學(xué)模型的研究中發(fā)揮了重要作用[27-28]。目前獼猴在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要用于傳染病研究、疫苗實(shí)驗(yàn)、藥理毒理學(xué)研究、器官移植研究等方面，獼猴的生理與病理特性與人類(lèi)高度相關(guān)。故認(rèn)為可采用獼猴作為濕熱證候模型動(dòng)物，并進(jìn)行中藥干預(yù)。目前廣東、云南、海南、廣西等地均有成熟獼猴實(shí)驗(yàn)基地，利用這些地區(qū)的天然濕熱氣候構(gòu)建濕熱證候模型是可行的。

除此之外，近年來(lái)腸道微生態(tài)、基因測(cè)序等在濕熱證候研究中受到了極大的重視，無(wú)菌動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物也是探索濕熱證候病證結(jié)合的理想模型動(dòng)物。

3.3 成模標(biāo)準(zhǔn)的確立目前評(píng)價(jià)濕熱證候模型缺乏統(tǒng)一的成模標(biāo)準(zhǔn)，這不僅僅阻礙了濕熱證候模型的發(fā)展，也為后續(xù)濕熱證候相關(guān)疾病的研究及藥物研發(fā)增加了阻力，是濕熱證候研究亟待解決的核心技術(shù)問(wèn)題。“整體觀念”和“辨證論治”為中醫(yī)學(xué)的兩大基本特點(diǎn)，濕熱證候及其他中醫(yī)證候模型的研究均不能將此二者忽視。成模標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)兼具針對(duì)性及客觀性，需要形成一套既符合中醫(yī)學(xué)辨證理論，又可以穩(wěn)定地在動(dòng)物模型上體現(xiàn)的指標(biāo)體系，故若能涵蓋表觀學(xué)、舌象圖片分析、舌組織HE染色病理、血液指標(biāo)檢測(cè)、蛋白組學(xué)等的指標(biāo)體系可能更有優(yōu)勢(shì)。濕熱證候由多因素致病，濕熱證候模型成模標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)有多個(gè)指標(biāo)，這些指標(biāo)間是相互關(guān)聯(lián)的，若只是用其中一個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)模型成功與否，與中醫(yī)學(xué)“整體觀念”顯然是相悖的。各指標(biāo)之間應(yīng)有一個(gè)主次的權(quán)重關(guān)系，以此判斷造模成功與否。

中醫(yī)證候研究應(yīng)始終基于臨床。深化濕熱證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究亦需基于臨床實(shí)際，細(xì)化成模標(biāo)準(zhǔn)，并參照濕熱證候理論進(jìn)行反向驗(yàn)證，不斷改進(jìn)。中醫(yī)證候模型的發(fā)展是中醫(yī)藥現(xiàn)代化一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，如何制作能更有效模擬的科學(xué)的中醫(yī)證候模型將是今后證候模型研究的方向。