石斛堿調節JNK信號通路對白血病細胞存活和上皮間質轉化的影響

郭濤， 紀冬梅， 李艷平， 盧陽， 弋莉， 王曉紅

（朝陽市中心醫院血液內科，遼寧朝陽 122000）

急性T 淋巴細胞白血病（T-acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一種起源于T細胞祖細胞惡性轉化的血液系統惡性腫瘤，占兒科病例的15%，占成人病例的25%[1]。在大多數兒童白血病患者中化療非常有效，且隨著對T細胞生物學理解的不斷加深，目前兒童的5 年存活率可達到65%～70%，而成人患者僅30%～50%[2-3]。T-ALL的治療方法包括單藥化療、分子靶向治療、造血干細胞移植和細胞免疫治療等，由于供體骨髓來源限制、費用高、并發癥嚴重，目前仍以化療為主要策略[4]。因此，增強治療效果、改善預后是T-ALL 治療亟待解決的問題，同時探索新的、更有效的藥物或治療策略也是十分重要的醫學內容。我國傳統名貴中藥金釵石斛是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有益胃生津、滋陰清熱、延年益壽的功效。石斛堿（dendrobine）是一種倍半萜類生物堿，是金釵石斛的主要有效成分之一，現代藥理學證明，其有抗高血壓、抗癌、鎮痛和解熱等作用[5-11]?；诖?，本研究以體外培養的人皮膚T 細胞淋巴瘤HuT-78細胞為研究對象，探討石斛堿對白血病細胞體外存活和轉移特性的影響，以期為T-ALL 的臨床治療提供實驗數據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養人皮膚T細胞淋巴瘤HuT-78細胞株來源于美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），以含有體積分數10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI 1640 培養基于37 ℃、體積分數5% CO2的恒溫培養箱中培養。鏡下觀察細胞生長狀態，當細胞融合率達到80%以上時進行消化傳代。

1. 2 藥物石斛堿（純度≥98%，貨號：2115-91-5），分子式：C16H25NO2，購自武漢天植生物技術有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為1 mg/mL母液，使用時用細胞培養基作相應稀釋。

1. 3 試劑RPMI 1640、胎牛血清、2.5 g/L 胰酶購自美國Gibco 公司； 細胞計數試劑盒8（CCK8）（用于細胞增殖及毒性檢測）、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒、結晶紫染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Matrigel 購自美國Invitriogen 公司；Transwell 小室購自北京優尼康生物技術有限公司；RIPA 裂解液購自南京碧云天生物技術公司；兔源Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3（cl-caspase-3）、cleaved caspase-9（cl-caspase-9）、細胞色素C（CC）、 E-鈣粘附素（E-cadherin）、N-鈣粘附素（N-cadherin）、Snail、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、p38、磷酸化p38（p-p38）、β-actin 單/多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.4 儀器CO2培養箱（美國ThermoForma 公司）；電泳儀及半干轉膜儀（美國伯樂公司）；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統（廣州云星儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州中亞凈化設備有限公司）；普通光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 CCK8實驗測定細胞存活率 將HuT-78細胞接種于96 孔板，待細胞貼壁后，隨機分為9 個石斛堿濃度（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL）組，每組設6 個復孔。每組分別給予對應濃度的石斛堿處理24 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續孵育4 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光度（D）值。細胞存活率（%）=（D藥物- D空白）/（D對照- D空白）×100%。D藥物：含藥孔D 值；D空白：不含細胞和藥物孔D 值；D對照：含細胞不含藥物孔D 值。根據細胞存活率結果選擇石斛堿無明顯細胞毒性（大于80%）的3 個濃度（1、2.5、5 μg/mL）進行后續實驗。

1.5.2 克隆形成實驗測定細胞增殖能力 接種細胞于6孔板內，每孔1×106個細胞，待細胞融合率達80%，分組后分別加入對應濃度的藥物處理24 h。收集各組細胞，每組取1 000 個細胞接種到6孔板中，繼續培養10 d。用體積分數20%乙醇固定克隆，0.4%結晶紫染色。鏡下觀察并計算各組克隆數。

1.5.3 流式細胞術測定細胞凋亡率 接種細胞于6 孔板內，每孔1 × 106個細胞，待細胞融合率達80%時，分組后加入對應終濃度藥物處理24 h。收集細胞，調整密度至1×106個/mL。嚴格按照試劑盒說明書操作，取100 μL 加入5 μL 的Annexin VFITC 和10 μL 的PI 染色液，室溫避光孵育15 min后，上機檢測。

1.5.4 Transwell 實驗測定細胞侵襲遷移能力 將HuT-78 細胞接種于提前用Matrigel 基質膠包被好的Transwell 小室上層，細胞密度為1 × 105個/mL，加入不含胎牛血清的培養液培養，Transwell 小室下層則加入正常細胞培養液。繼續培養24 h 后，用無菌棉簽拭去Matrigel 基質膠和小室上層細胞，后用4%多聚甲醛固定小室，再用0.1%結晶紫染色細胞，流水沖洗去除多余染料并晾干。顯微鏡下每組隨機選取5個視野，對染色細胞進行計數統計。實驗至少重復3次，每組6個復孔。

1. 5. 5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Ki67、Bcl-2、Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9、CC、E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-2、MMP-9、JNK、p38表達水平 將HuT-78細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分組加入不同濃度石斛堿，繼續培養24 h后收集各組細胞。用RIPA 蛋白裂解液于冰上裂解細胞提取細胞總蛋白，4 ℃離心收集上清，用BCA 試劑盒定量蛋白。取等量蛋白質用12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白后，轉移蛋白質到PVDF 膜。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉蛋白質2 h，分別加入稀釋度為1∶200的一抗（Ki67、Bcl-2、Bax、cl-caspase-3、cl-caspase - 9、 CC、 E-cadherin、 N - cadherin、Snail、MMP-2、MMP-9、JNK、p38），4 ℃孵育過夜。棄去一抗，加入辣根過氧化物酶標記的對應二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL 于暗室曝光顯影。以β-actin 為內參，通過凝膠成像儀分析目的蛋白與內參蛋白的灰度計算其相對蛋白表達水平（p）。

1.6 統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，實驗結果以均數±標準差(±s)表示。多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 石斛堿抑制體外培養HuT-78 細胞的增殖CCK8 法測定不同濃度石斛堿處理后HuT-78 細胞的存活率，結果顯示：隨著石斛堿處理濃度的增加，HuT-78 細胞存活率逐漸降低，且濃度大于5 μg/mL時細胞存活率低于80%，并存在統計學差異（P ＜0.05 或P ＜0.01），見圖1-A。故選擇無明顯細胞毒性的1、2.5和5 μg/mL進行后續實驗。

克隆形成實驗觀察石斛堿對HuT-78細胞體外增殖能力的影響，結果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地抑制HuT-78細胞的克隆形成數量和增殖蛋白Ki67 表達水平（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖1-B，-C。

圖1 石斛堿對HuT-78細胞增殖能力的影響Figure 1 Effects of DEN on proliferation of HuT-78 cells

2.2 石斛堿促進體外培養HuT-78細胞的凋亡流式細胞術和Western Blot實驗觀察石斛堿對HuT-78細胞凋亡的影響，結果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地增加HuT-78 細胞的凋亡率，下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，上調促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9、CC 表達水平（P ＜0.05或P ＜0.01）。見圖2-A，-B。

2.3 石斛堿抑制體外培養HuT-78 細胞上皮間質轉化Transwell 實驗和Western Blot 實驗觀察石斛堿對HuT-78細胞侵襲能力的影響，結果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地減少HuT-78 細胞侵襲數量，下調間充質標記蛋白Ncadherin、Snail、MMP-2、MMP-9表達水平，上調上皮標記蛋白E-cadherin 表達水平（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3-A，-B。

2.4 石斛堿促進體外培養HuT-78 細胞JNK、p38磷酸化表達Western Blot實驗觀察石斛堿對HuT-78細胞JNK、p38磷酸化的影響，結果顯示：與空白對照組比較，石斛堿劑量依賴性地增加p-JNK/JNK、p-p38/p38蛋白表達水平（P ＜0.05）。見圖4。

2.5 石斛堿逆轉JNK抑制劑SP600125對增殖、凋亡及上皮間質轉化相關蛋白Ki67、MMP-2、clcaspase-3、p-JNK/JNK 表達的影響Western Blot實驗觀察石斛堿和/或SP600125 對細胞Ki67、MMP-2、cl-caspase-3、p-JNK/JNK 表達水平的影響，結果顯示：與空白對照組比較，石斛堿組細胞低表達Ki67、MMP-2蛋白，高表達cl-caspase-3、p-JNK/JNK 蛋白（P ＜0.05）；SP600125 組細胞則高表達Ki67、MMP-2蛋白，低表達cl-caspase-3、p-JNK/JNK 蛋白（P ＜0.05）；與SP600125單獨處理組比較，石斛堿和SP600125 共同處理組細胞Ki67、MMP-2 蛋白表達降低，cl-caspase-3、p-JNK/JNK蛋白表達增加（P ＜0.05）。見圖5。

3 討論

圖2 石斛堿對HuT-78細胞凋亡率的影響Figure 2 Effects of DEN on apoptotic rate of HuT-78 cells

正常情況下，T 細胞發育受到系統性嚴格調控，是造血祖細胞遷移到胸腺分化為功能多樣的T淋巴細胞亞群的過程[12]。在此過程中，致癌基因的異常激活和抑癌基因表達降低或缺失均能導致胸腺前體不受控制的克隆擴張，進而導致T-ALL 發生[13]。因此，抑制T 淋巴細胞不正常分化是治療T-ALL 的關鍵。Ki67 是一種增殖細胞核抗原，與細胞有絲分裂密切相關，被認為是腫瘤標記物之一[14]。在本研究中，我們發現石斛堿能抑制體外培養的HuT-78細胞增殖能力及增殖關鍵蛋白Ki67的表達水平，且當濃度大于5 μg/mL時可對細胞產生明顯的毒性作用。

此外，本研究發現石斛堿除在一定濃度范圍內劑量依賴性地抑制人HuT-78細胞增殖外，還能誘導腫瘤細胞凋亡，并調節凋亡關鍵蛋白的表達（下調抗凋亡蛋白Bcl-2，上調促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9和CC）。細胞凋亡是機體生理和病理過程中均存在的細胞程序性死亡形式，而細胞凋亡抵抗是腫瘤發展進程的特點之一。在正常條件下，Bcl-2能夠與Bax形成異源二聚體，維持膜電位阻止CC釋放。當細胞受到各種異常刺激后，Bax 表達升高，Bax 自身形成同源二聚體從而拮抗Bcl-2 對膜電位的維持作用，CC 從線粒體中釋放并與pro-caspase-9形成凋亡體激活caspase-9，進而激活下游級聯caspase-3，從而引起細胞凋亡，這是經典的線粒體依賴的凋亡通路[15]。本研究結果表明石斛堿促腫瘤細胞凋亡作用的機制可能是通過此通路實現的，但仍不排除非線粒體依賴的凋亡通路參與其中。

腫瘤細胞發生上皮間質轉化易于侵襲轉移，在癌癥的發展進程中發揮著重要作用。Ecadherin是一種重要的細胞粘附因子，其表達下調或缺失，伴隨著N-cadherin 的表達上調，通過與β-catenin 連接形成復合物維持上皮細胞穩定性，促進細胞間的相互作用。Snail 結合到E-cadherin的啟動子上可抑制其基因轉錄，從而參與上皮間質轉化進程[16-17]。另外，Khalil 等[18]報道，MMP-2和MMP-9 可作為腫瘤侵襲和遷移特性的標記物，其表達水平可解釋腫瘤侵襲性高低。本研究結果表明，石斛堿可劑量依賴性地抑制Hut-78 細胞的侵襲遷移，同時降低N-cadherin、Snail、MMP-2和MMP-9 蛋白表達，增加E-cadherin 蛋白表達，進而有效維持細胞間的粘附，降低細胞極性丟失，從而降低HuT-78細胞上皮間質轉化發展進程。

圖3 石斛堿對HuT-78細胞上皮間質轉化的影響Figure 3 Effects of DEN on epithelial mesenchymal transition of HuT-78 cells

圖4 石斛堿對HuT-78細胞JNK、p38磷酸化表達的影響Figure 4 Effects of DEN on phosphorylation of JNK and p38 in HuT-78 cells

圖5 石斛堿和/或SP600125對HuT-78細胞Ki67、cl-caspase-3、MMP-2、p-JNK/JNK表達水平的影響Figure 5 Effects of DEN and/or SP600125 on expression levels of Ki67，cl-caspase-3，MMP-2，p-JNK/JNK in HuT-78 cells

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的一個重要分支，在細胞周期、凋亡和應激等生理和病理過程中起著重要作用。JNK信號通路被上游信號激活后，胞質中的JNK 移位到細胞核，進一步使核內的轉錄因子c-Jun 氨基末端63/73 位的絲氨酸殘基磷酸化，進而啟動線粒體依賴的細胞凋亡[19-20]。p38 與JNK 性質相似，同屬于應激激活的蛋白激酶。研究表明，JNK/p38參與了上皮間質轉化的調控過程，Zhu等[21]發現，通過激活MAPK/JNK/p38信號通路，人卵巢癌細胞的上皮間質轉化能力受到明顯抑制。那么，石斛堿對人HuT-78細胞存活和轉移的抑制作用是否與JNK 信號通路激活相關？本研究結果表明，石斛堿能激活JNK 信號通路，且能部分抵消JNK 抑制劑的干預作用，從而實現對人HuT-78細胞增殖、凋亡和侵襲轉移的調節作用。但石斛堿對人HuT-78細胞的作用是否還有其他信號通路的參與，還有待深入研究。

綜上所述，本研究以HuT-78 細胞為研究對象，探討石斛堿對白血病細胞增殖、凋亡和轉移的影響及其機制。結果表明，石斛堿可能通過增加JNK 信號通路磷酸化活化水平，實現抑制白血病細胞的存活和轉移特性的作用。