長期笑氣吸入對大鼠肝臟毒副作用的影響

孫培鳴，王 麗，孫宏偉，楊建武，趙曉波，張 瑾，楊鶴鳴＊，崔 彥

（1.戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學中心 普通外科，北京 100101；2.中日友好醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100029；3.清華大學第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100016；4.戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學中心 病理科，北京 100101）

笑氣，即一氧化二氮（nitrous oxide，N2O），是室溫下無色、稍帶甜味的氣體。笑氣有輕微的麻醉作用，吸入后可使人喪失痛覺，感到欣快、發(fā)笑，甚至產(chǎn)生幻覺。臨床上笑氣常用作吸入性鎮(zhèn)痛麻醉藥物，較廣泛用于外科、婦產(chǎn)科及口腔科等[1，2]。近年來，笑氣在娛樂場所濫用[1～3]。目前國內(nèi)外對笑氣濫用危害的報道多集中于神經(jīng)損傷領域，對肝臟毒副作用的研究未見相關報道。但在臨床診療中我們發(fā)現(xiàn)部分患者的肝臟轉(zhuǎn)氨酶明顯增高，提示笑氣有導致肝功能損傷的可能。本研究擬探討長期笑氣吸入對大鼠肝臟功能、細胞凋亡及組織學特點的影響，從而提高對笑氣濫用危害的認識，并為其防治提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年（8 周齡）Wistar 雄性大鼠10 只，體重200～250g，購買自北京華阜生物科技有限公司，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動物實驗中心（SPF 級），自由進食水。本實驗經(jīng)中日友好醫(yī)院研究倫理委員會審核批準，實驗過程符合動物實驗研究管理規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

醫(yī)用氧氣及N2O （北京普萊克斯實用氣體有限公司），一步法TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒（KGA7073，凱基生物），小動物氧濃度控制系統(tǒng)（動物染毒箱，上海玉研科學儀器有限公司）、倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（Ci-S/ DS-U3，日本尼康公司）、全自動生化分析儀（7180，日本日立公司）、正置顯微鏡BX51 及攝像頭DP72 （日本Olympus公司）。

1.3 動物分組及笑氣吸入實驗

將Wistar 大鼠隨機分為2 組：笑氣暴露組及吸氧對照組，每組5 只，置于動物染毒箱內(nèi)。笑氣暴露組暴露在N2O 和O2（1：1）混合氣體中，吸氧對照組暴露在氧氣中，氧濃度控制在50%。2 組氣流速度均為1.5L/min，吸入時間120min/d，連續(xù)60d。

1.4 大鼠肝功能檢測

笑氣連續(xù)吸入60d 后，自大鼠股靜脈采集血液約2ml，離心10min（3000r/min），留取血清。采用全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平，分析比較2 組大鼠肝功能變化。

1.5 大鼠肝細胞凋亡檢測

實驗結(jié)束后處死大鼠，選取肝臟左外葉組織，大小約1.5cm×1cm×0.2cm。采用TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測大鼠肝細胞凋亡。肝臟組織常規(guī)石蠟包埋、切片后，按照試劑盒步驟進行TUNEL 檢測。然后利用倒置熒光顯微鏡觀察并在200 倍視野下采集圖像。利用ImageJ 軟件，統(tǒng)計視野下細胞亮綠色光的光密度（IOD=IntDen/Area），每張切片統(tǒng)計3 個視野。比較分析2 組間肝細胞凋亡的差異。

1.6 大鼠肝臟組織學觀察

常規(guī)石蠟包埋切片后HE 染色。利用正置顯微鏡觀察肝臟的組織學結(jié)構(gòu)特點，采集圖像并比較分析2 組的差異。

圖1 2 組大鼠肝功能檢測結(jié)果的比較（n=5）

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，做圖軟件采用Graphpad Prism 5。計量資料以±s 表示，2 組間比較采用t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝功能的改變

大鼠肝功能檢測表明笑氣暴露組ALT、AST的水平均高于吸氧對照組。圖1 示，笑氣暴露組及吸氧對照組大鼠ALT 檢測值分別為：98.80±21.37U/L，74.40±6.07 U/L，2 組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.04）。

笑氣暴露組及吸氧對照組大鼠AST 檢測值分別為：270.20±44.24U/L，220.60±20.87U/L，2 組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.309）。

2.2 大鼠肝臟細胞凋亡的比較

TUNEL 檢測結(jié)果（圖2A、2B，見封二）顯示大鼠肝細胞凋亡，2 組間差異無統(tǒng)計學意義。笑氣暴露組大鼠肝臟細胞IOD 值為0.0486±0.0055，吸氧對照組為0.0338±0.0015。

2.3 大鼠肝臟組織學觀察

顯微鏡下觀察，與吸氧對照組（圖3A，見封二）相比，笑氣暴露組（圖3B，見封二）大鼠肝臟組織學結(jié)構(gòu)特點無明顯改變。HE 染色顯示2 組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索以小葉靜脈為軸心放射狀排列，匯管區(qū)位于小葉周圍，分布規(guī)律，均未見肝細胞變性壞死及炎癥細胞浸潤。

圖2 2組大鼠肝細胞凋亡的比較。TUNEL檢測結(jié)果顯示笑氣暴露組（圖2A）和吸氧對照組（圖2B）大鼠肝細胞的IOD值間無統(tǒng)計學差異（P=0.408）。圖3 2組大鼠肝臟組織學特點比較（HE×200）。HE染色顯示，與吸氧對照組（圖3A）相比，笑氣暴露組（圖3B）大鼠肝臟組織學結(jié)構(gòu)特點無明顯改變。大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見肝細胞變性壞死及炎癥細胞浸潤。

3 討論

3.1 笑氣濫用在國內(nèi)外呈逐步增多趨勢

18 世紀后期，Joseph Pruestly 首先認識并人工合成了N2O，隨后Humphrey Davy 發(fā)現(xiàn)該氣體能夠使人感到欣快、發(fā)笑并喪失痛覺，故稱之為“笑氣”。因吸入后可以使人產(chǎn)生短暫的欣快感，從19 世紀開始笑氣就被用于娛樂性消費并曾一度在歐洲上流社會圈非常流行。近年來，國內(nèi)外的娛樂場所為了迎合青少年追求刺激的心態(tài)，將N2O 氣體微型壓縮裝置（“笑氣彈”或“whippets”）中的氣體充入氣球中吸食，以獲得身體上的欣快感和迷幻效果[3]。2016年世界毒品調(diào)查報告顯示，笑氣已成為世界第七大流行濫用藥物。文獻報道在歐美等西方國家，笑氣的使用人群約占29.4%～38.6%[4]。目前，小罐裝笑氣（8g/罐）在歐美等國家及地區(qū)的娛樂場所濫用。數(shù)據(jù)顯示笑氣濫用人群的平均年齡約在24.3 歲，其中青少年濫用率可達12%～20%，國內(nèi)笑氣濫用的病例報道也呈逐步增多趨勢[1，5，6]。

3.2 笑氣濫用對肝臟的毒副作用及機制尚不明確

笑氣較為穩(wěn)定，吸入后絕大部分以原藥形式呼出體外，其余由皮膚蒸發(fā)，或排至尿道和腸道中，經(jīng)腸道細菌的生物作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和氮等[6]。笑氣的擴散性較強，吸入后可導致肺泡內(nèi)氧稀釋，氧分壓下降，引起彌漫性缺氧。研究表明，長期接觸、濫用笑氣可導致慢性中毒，包括貧血和神經(jīng)系統(tǒng)損害等臨床癥狀[7]。近年來國內(nèi)外研究認為笑氣導致的慢性中毒主要與其影響體內(nèi)維生素B12（鈷胺素）的代謝相關[8]。另一可能原因為笑氣吸入導致的缺氧引起神經(jīng)系統(tǒng)供氧不足，同時神經(jīng)系統(tǒng)興奮、耗氧增加，進一步加重了缺氧，進而導致神經(jīng)系統(tǒng)損傷[9]。

目前國內(nèi)外對笑氣濫用危害的報道多集中于神經(jīng)損傷領域，而對其肝臟毒副作用關注較少。肝臟是人體最重要的消化器官，具有合成、代謝及解毒等重要的生理功能。其解毒機制為外來或體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，在肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒或溶解度大的物質(zhì)，隨膽汁或尿液排出體外，以保護機體、維持正常的生理功能[10]。笑氣吸入對肝臟的毒副作用及機制尚不明確。綜合國內(nèi)外文獻報道，多數(shù)笑氣中毒患者的肝功能無異常，部分患者出現(xiàn)肝功能損傷，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高，經(jīng)對癥治療后可逐步恢復正常[11～13]。其可能的原因為，笑氣中毒主要影響維生素B12的代謝，而肝臟是體內(nèi)貯備維生素B12的主要器官，約占總量的80%～90%，在維生素的代謝中發(fā)揮重要作用[14]。因此肝臟可能為笑氣吸入中毒潛在的神經(jīng)系統(tǒng)外靶器官。另一方面，長期笑氣吸入可導致缺氧。肝臟是高代謝、高耗氧器官，急慢性缺氧均可影響肝臟功能。研究表明，缺氧狀態(tài)下肝細胞三羧酸循環(huán)抑制，無氧酵解代償性增強，乳酸分泌增多，產(chǎn)生氧自由基，引起肝細胞變性甚至壞死[15]。另外缺氧也可導致肝細胞凋亡增加，引起肝功能損傷[16，17]。ALT 和AST 能敏感提示肝細胞損傷及其程度，其中ALT 主要反映急性肝細胞損傷，AST 主要反應肝細胞損傷程度。有文獻指出，肝臟功能損傷可引起維生素B12的貯備障礙和釋放增加，導致血清維生素B12水平升高[18]。這有可能是臨床診療過程中，笑氣中毒神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者的血清維生素B12水平正常或升高的原因之一。

3.3 笑氣吸入可導致大鼠肝功能損傷

研究中我們利用小動物氧濃度控制系統(tǒng) （動物染毒箱） 觀察長期笑氣吸入對大鼠肝臟的毒副作用及可能機制。結(jié)果顯示：（1）大鼠肝功能損傷，表現(xiàn)為笑氣暴露組ALT 和AST 的檢測值均高于吸氧對照組，其中ALT 的升高有統(tǒng)計學差異；（2）大鼠肝細胞凋亡趨勢增加，TUNEL 檢測結(jié)果顯示笑氣暴露組大鼠肝細胞凋亡值高于吸氧對照組，但兩者相比無統(tǒng)計學意義；（3）大鼠肝臟組織學特點變化不明顯，HE 染色未見明確病理學改變。綜合實驗結(jié)果分析，長期笑氣吸入對肝臟毒副作用為導致肝功能損傷，引起肝細胞凋亡趨勢增加，但并未導致肝細胞變性或壞死等組織病理學改變。且從轉(zhuǎn)氨酶數(shù)據(jù)分析，笑氣對肝臟毒副作用為急性肝損傷，肝細胞損傷程度并不嚴重。故臨床上笑氣中毒導致神經(jīng)系統(tǒng)損傷合并肝功能損傷的患者經(jīng)保肝藥物等對癥治療后，肝功能可恢復正常。同時因肝臟有較強的代償功能，若肝功能損傷在其代償范圍之內(nèi)，肝臟轉(zhuǎn)氨酶可不出現(xiàn)異常。這可能是多數(shù)笑氣中毒神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者肝功能正常的原因。有關笑氣引起肝功能損傷和神經(jīng)損傷之間的關系，笑氣引起肝功能損傷、肝細胞凋亡趨勢增加的機制及兩者之間的關系尚不明確，有待于進一步研究。本實驗的不足之處為沒有觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，如線粒體等細胞器。樣本量較偏少，仍需大樣本實驗加以驗證。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果提示，在長期笑氣吸入患者的臨床診治中應警惕肝功能損傷的可能，加強對肝功能的監(jiān)測和保護。