microRNA在乳腺癌細胞中的功能研究及其作為乳腺癌生物標(biāo)志物的評估

夏赟，王清水，林堯

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350100

乳腺癌是一種由于細胞增殖失控而引發(fā)的嚴(yán)重危及人類尤其是女性生命的疾病，每年都有大量女性因為乳腺癌病灶轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而喪生。在所有女性惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率是最高的。乳腺癌的病因與家族遺傳因素、雌激素水平、基因突變和生活方式有關(guān)[1]。由于現(xiàn)代人的飲食習(xí)慣和工作壓力，以及環(huán)境污染及各種食品添加劑等造成的激素分泌紊亂，使得乳腺癌的發(fā)病率每年呈上升趨勢。乳腺癌具有不同的腫瘤間和腫瘤內(nèi)非均勻性，并且在受影響的個體之間存在廣泛的腫瘤差異。病灶轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗和患者最終死亡的主要原因，乳腺癌細胞不斷擴散，侵襲人體其他組織器官并引起機體衰竭，最終導(dǎo)致死亡。雖然乳腺癌的早期診斷和檢測已經(jīng)促進了死亡率的下降，但預(yù)防、檢測和治療方面的進一步進展對于改善乳腺癌預(yù)后和生存來說仍是迫切需要的。傳統(tǒng)的乳腺癌治療方法，如手術(shù)、放療、化療和激素治療等，在早期乳腺癌的治療中具有一定的療效，但在治療后的反應(yīng)或感覺、毒性和耐藥性方面不可避免地存在副作用。目前，尋找穩(wěn)定有效、非侵入的生物標(biāo)志物來準(zhǔn)確診斷乳腺癌，以及尋求新的治療乳腺癌的方法至關(guān)重要。近年來，microRNA（miRNA）因其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用而開始引起廣泛關(guān)注。

1 miRNA及其在腫瘤發(fā)生中的作用

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，最初于上世紀(jì)90年代早期在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。miRNA先通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pri-miRNA，后經(jīng)切割成有循環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀前體pre-miRNA，隨后運輸?shù)郊毎|(zhì)中被剪切，得到成熟的miRNA[2-4]。這些與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合的成熟的miRNA被認為可以調(diào)節(jié)至少30%的蛋白編碼基因的表達[5]。

miRNA可以促進或抑制腫瘤的發(fā)生。例如miR-372具有通過下調(diào)抑癌基因LATS2的表達來控制胃癌細胞生長、細胞周期和細胞凋亡的致癌特性[6]；膽囊收縮素B受體（CCKBR）被miR-148b靶向并顯著抑制胃癌細胞的生長[7]；miR-708-5p在非小細胞型肺癌中表達上調(diào)，并可能通過調(diào)控TMEM88促進腫瘤生長和疾病進展[8]；miR-30a-5p是非小細胞型肺癌發(fā)病機理中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)非小細胞型肺癌的細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，抑制腫瘤發(fā)生[9-12]。癌癥與基因組改變之間的關(guān)聯(lián)性揭示了miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用，miRNA的異常表達同腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性相關(guān)，miRNA表達的變化會影響具有致癌或抑癌功能的靶mRNA編碼蛋白的活性，進而影響腫瘤發(fā)生進程[13-14]。此外，某些miRNA的表達水平與乳腺癌的形態(tài)學(xué)特征、免疫組化、組織病理學(xué)參數(shù)、臨床結(jié)局、預(yù)后及治療反應(yīng)密切相關(guān)[15]。這些研究表明miRNA在包括乳腺癌在內(nèi)的癌癥的診斷和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 miRNA在乳腺癌中的研究

過去幾十年，科研人員發(fā)現(xiàn)了許多在乳腺癌組織和正常組織中差異性表達的miRNA。同時，這些miRNA在乳腺癌病人和正常人的血清中的表達量有顯著性差異。在乳腺癌細胞和健康人細胞中關(guān)于miRNA的研究也得到類似結(jié)果。這些結(jié)果預(yù)示著miRNA通過腫瘤抑制和致癌的機制在乳腺癌中發(fā)揮作用[16-17]。與乳腺癌相關(guān)的miRNA通過參與復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)乳腺腫瘤的某些特性，如維持生長和增殖信號、啟動轉(zhuǎn)移和入侵、抵抗凋亡、誘導(dǎo)血管生成、提高新陳代謝水平、支持細胞免疫逃逸等。

研究表明，miRNA通過與細胞周期蛋白家族、蛋白激酶及其抑制劑和其他生長促進因子或抑制因子的相互作用，在乳腺癌細胞的細胞周期進程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，進而影響細胞增殖水平。細胞周期對于細胞增殖的調(diào)控至關(guān)重要。健康細胞的分裂代數(shù)和數(shù)量是有限的，而細胞分裂的數(shù)量很大程度上取決于細胞在組織內(nèi)的最佳細胞密度。一旦達到一個有限的細胞密度，健康細胞將停止增殖。然而這種生理適應(yīng)性的細胞周期阻滯機制在癌細胞中是異常的。Zhou等報道，miRNA模擬上調(diào)miR-143可以抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK5、絲裂原活化蛋白激酶MAP3K7和周期蛋白D1的表達，從而進一步降低乳腺癌細胞的活力，而抑制miR-143則可逆轉(zhuǎn)這些作用[18]。Wang等研究表明，miR-455過表達可通過CDC2相關(guān)蛋白激酶CDK14和周期蛋白D1表達的雙重抑制作用抑制乳腺癌細胞的增殖，并促進腫瘤抑制因子p21的表達[19]。

正常細胞的染色體或遺傳信息的破壞可導(dǎo)致程序性細胞死亡信號通路的誘導(dǎo)，即引發(fā)細胞凋亡，以此作為一種防止細胞癌變的防御機制。但即使腫瘤細胞的遺傳信息受到嚴(yán)重破壞，腫瘤細胞仍對凋亡反應(yīng)具有抵抗性。細胞凋亡途徑的任何一個特定點的破壞都可能觸發(fā)乳腺細胞的惡性轉(zhuǎn)化，提高細胞活力。研究表明，miRNA可以通過靶向或啟動某些細胞凋亡途徑的特定點，在乳腺癌復(fù)雜的凋亡調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用。Sharma等發(fā)現(xiàn)促凋亡腫瘤抑制因子p53通過與miR-191-5p啟動子區(qū)域的p53響應(yīng)元件結(jié)合，轉(zhuǎn)錄下調(diào)了miR-191-5p的表達。在乳腺癌細胞中，過表達miR-191-5p導(dǎo)致凋亡小體數(shù)量減少和caspase-3/-7活性降低，而anti-miR-191-5p逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)。此外，miR-191-5p水平的升高能夠下調(diào)其潛在靶基因SOX4，從而進一步降低了p53在乳腺癌細胞中的表達，提示p53-mir-191-SOX4調(diào)控反饋回路的存在[20]。

癌癥細胞具有松散的細胞基質(zhì)相互作用，與非癌癥細胞相比，它們對細胞外基質(zhì)的黏附更少，從而使它們能夠通過周圍的血液或淋巴系統(tǒng)入侵或轉(zhuǎn)移。研究表明，影響乳腺癌轉(zhuǎn)移和細胞侵襲的某些miRNA的活性是由FOXP3和KAT2B誘導(dǎo)的。Zhang等發(fā)現(xiàn)，miR-200家族的2個成員，miR-200c和miR-141，都是由FOXP3誘導(dǎo)的，而KAT2B起協(xié)調(diào)作用[21]。隨著腫瘤病情的發(fā)展，腫瘤會迅速擴展到現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)之外，并導(dǎo)致形成一個比健康組織氧濃度低的腫瘤微環(huán)境，而這種腫瘤微環(huán)境是乳腺癌血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子。乳腺腫瘤的持續(xù)增殖和生長會引發(fā)新血管生成，從而為腫瘤提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，促進腫瘤進一步發(fā)展。miR-210是缺氧時最一致和最顯著的誘導(dǎo)miRNA，Camp等對乳腺癌細胞進行了缺氧過程miRNA測序數(shù)據(jù)分析，檢測到miR-210-3p 的上調(diào)[22]。

還有一些miRNA被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中發(fā)揮作用。例如，miR-99a既是癌基因FGFR3的調(diào)節(jié)因子，也是導(dǎo)致乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移顯著減少的腫瘤抑制因子，血清miR-99a水平與臨床結(jié)果相關(guān)[23]。此外，據(jù)報道m(xù)iR-9與乳腺癌的復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)，也是乳腺癌診斷和預(yù)后的有前途的生物標(biāo)志物。Bertoli等回顧了與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的miRNA，并證實miR-9正在成為乳腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[24]。Sporn等通過分析來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的985例乳腺癌的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-9低表達似乎具有保護作用[25]。Li等報道，miR-29c通過靶向DNMT3B參與抑制乳腺癌的進展[26]。miR-196a被確定為通過靶向UBE2C來促進乳腺癌細胞生長[27]。除此之外，還有許多miRNA被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。開發(fā)基于miRNA的新的生物療法，可以為乳腺癌的治療提供新的思路和方法。

3 miRNA作為乳腺癌生物標(biāo)志物

由于miRNA與癌癥發(fā)生相關(guān)，因此人們正在尋求miRNA標(biāo)記作為新的臨床診斷靶標(biāo)，以進一步對乳腺癌進行分型，并預(yù)測轉(zhuǎn)移或治療耐藥性。miRNA作為生物標(biāo)志物靶標(biāo)的潛力得益于其在血液中的穩(wěn)定性，以及其承受反復(fù)冰凍和解凍循環(huán)的能力[28]。Iorio等發(fā)現(xiàn)miRNA-10b在晚期乳腺癌中表達水平較高，可作為乳腺癌的檢測指標(biāo)[29]。Biagioni等發(fā)現(xiàn)miRNA-10b基因位于染色體2q31.1上的同源盒D10（HOXD10）基因簇上，位于HOXD-4和HOXD-8之間的間隔中[30]。Ohuchi?da等提出miRNA-10b的主要靶基因HOXD10可以抑制多種實體瘤的轉(zhuǎn)移[31]。與健康人相比，miRNA-10b水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺導(dǎo)管癌患者的血液循環(huán)中顯著增加，提示miRNA-10b可以作為檢測乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物[32]。在循環(huán)腫瘤細胞（CTC）患者中發(fā)現(xiàn)8種miRNA（miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-210、miR-375 和 miR-801）顯著升高[33]。在另一項研究中，與未轉(zhuǎn)移的乳腺癌相比，早期轉(zhuǎn)移的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了更高水平的miR-105[34]。研究還發(fā)現(xiàn)過表達miR-105可促進體內(nèi)轉(zhuǎn)移。miR-17和miR-155被認為是轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在鑒別因子[35]。這些miRNA中的許多已經(jīng)在轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌樣本中被識別為標(biāo)記物，突顯了miRNA作為區(qū)分非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的生物標(biāo)志物的重要性和潛在應(yīng)用價值。目前，利用miRNA作為生物標(biāo)志物進行可靠的臨床檢測仍然存在困難，還須深入的研究。

4 miRNA在乳腺癌診斷和治療中的前景

使用miRNA進行癌癥治療的最大優(yōu)勢之一是它可以靶向涉及相似途徑的多個基因[36]。以miRNA為靶點的治療策略可能成為一種新的多途徑的腫瘤治療策略。例如，基于miR-9在乳腺癌中表達的特異性及其進入體液循環(huán)和穩(wěn)定性的能力，可以檢測人血、尿或膽汁中的miR-9水平，作為一種潛在的無創(chuàng)乳腺癌腫瘤標(biāo)志物[24]。此外，基于miR-9的藥物也是一種有前途的乳腺癌治療方法。為了使miRNA在包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的治療領(lǐng)域中更加成功，目前科學(xué)家正在探索改變合成miRNA的方法，例如通過改變某些結(jié)構(gòu)元件，以便使其在體內(nèi)更容易地轉(zhuǎn)移至宿主細胞[37]。目前離miRNA能夠?qū)嶋H應(yīng)用到乳腺癌臨床治療和藥物研發(fā)階段還有一定的距離，基于miRNA的治療方式和診斷方法被充分利用之前仍然存在諸多困難和挑戰(zhàn)，因此還需要更多科研人員的努力。