基于MALDI-TOF MS技術(shù)子宮內(nèi)膜癌血清學(xué)診斷模型的建立及驗(yàn)證

吳艷花 ，孫克娜 ，劉曉斐 ，王佳

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科；b.衛(wèi)勤部；山東 濟(jì)南 250031

［關(guān)鍵字］ 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）；子宮內(nèi)膜癌；診斷模型；腫瘤標(biāo)記物

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是發(fā)生于子宮的惡性上皮性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近年來，國(guó)內(nèi)外EC的發(fā)病率不斷升高，并有年輕化的趨勢(shì)[1]。EC早期癥狀多無特異性，常表現(xiàn)為不規(guī)則陰道出血和排液等。EC晚期多存在腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，治療效果及預(yù)后欠佳，但Ⅰ期低危型EC患者術(shù)后5年存活率可高達(dá)80%～93%[2]，因此早診斷、早治療對(duì)提高EC治愈率降低死亡率有重大意義。臨床上EC的早期診斷主要依賴經(jīng)陰道B超、診斷性刮宮和宮腔鏡下組織活檢等有創(chuàng)檢查，血清學(xué)標(biāo)志物CA125和HE4診斷EC的特異性不高，目前尚缺乏敏感性、特異性的血液學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（ma?trix-assisted laserdesorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種高通量、高靈敏度及高特異性的新型軟電離生物質(zhì)譜分析技術(shù)，操作簡(jiǎn)便方便無創(chuàng)，可廣泛應(yīng)用于基因突變檢測(cè)、基因多態(tài)性研究、微生物鑒定、腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)等方面。弱陽離子交換磁珠（weak cation-exchange chromatography mag?netic beads，MB-WCX）對(duì)血清中低豐度蛋白有較好的富集能力，我們擬通過MB-WCX聯(lián)合MAL?DI-TOF MS技術(shù)，檢測(cè)EC患者血清和子宮內(nèi)膜良性病變患者血清中的蛋白表達(dá)、分析差異蛋白，篩選出EC患者和子宮良性病變血清中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)/肽，建立EC診斷預(yù)測(cè)模型，以期為EC的早期篩查及輔助診斷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年6月至2020年6月就診于解放軍第九六〇醫(yī)院的EC患者血清標(biāo)本53例，年齡54.96±9.01歲，中位年齡55歲；病理類型腺癌51例，腺癌伴鱗狀上皮化生2例；根據(jù)子宮內(nèi)膜癌國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期（2009）標(biāo)準(zhǔn)，ⅠA期24例（肌層浸潤(rùn)<1/2），ⅠB期15例（肌層浸潤(rùn)≥1/2），Ⅱ/Ⅲ期8例（浸潤(rùn)宮頸間質(zhì)）。高/中分化43例，低分化8例。患者均經(jīng)術(shù)后病理初次確診為子宮內(nèi)膜癌，未經(jīng)過放化療及抗癌藥物治療，無其他腫瘤等惡性病史。收集同期就診的子宮內(nèi)膜良性病變患者（非典型增生、單純?cè)錾⑾⑷猓┭鍢?biāo)本37例，年齡47.41±10.32歲，中位年齡50歲；其中子宮內(nèi)膜非典型增生患者19例、子宮內(nèi)膜單純?cè)錾颊?0例、子宮內(nèi)膜息肉患者8例。所有標(biāo)本均在患者入院后接受手術(shù)、治療前收集；所有入組者均排除子宮之外其他部位腫瘤、嚴(yán)重出血、急性或慢性感染、自身免疫性疾病病史。

1.2 血清蛋白的提取

采集晨起空腹靜脈血4 mL，分離血清，-80℃保存。實(shí)驗(yàn)前將凍存的標(biāo)本逐步復(fù)融（-20℃放置8 h，4℃直至標(biāo)本融化）。采用Bruker公司MBWCX試劑盒提取蛋白質(zhì)/多肽。為保證結(jié)果的一致性，所有標(biāo)本同時(shí)復(fù)融，同時(shí)進(jìn)行蛋白提取。

1.3 MALDI-TOF MS檢測(cè)

取1 μL提取的蛋白樣品點(diǎn)樣于AnchorChip靶板上，干燥后取1 μL新鮮配置的基質(zhì)（6 mg HCCA，50% CAN，2% TFA）點(diǎn)于樣品點(diǎn)上，室溫干燥后上機(jī)。應(yīng)用FlexControl軟件檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度 5，優(yōu)化范圍 m/z為 1000～10 000 Da，激光強(qiáng)度為70%，每個(gè)樣品點(diǎn)累積轟擊100×10次。所有標(biāo)本均進(jìn)行復(fù)孔點(diǎn)樣。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用ClinProTools 3.0和FlexAnalysis軟件。經(jīng)基線去除、平滑、歸一化等處理，剔除小于1000 Da的峰，以排除基質(zhì)峰干擾。對(duì)信噪比（S/N）>5的峰做統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算2組中差異蛋白的平均峰下面積和平均峰值強(qiáng)度。差異蛋白的統(tǒng)計(jì)分析采用遺傳算法（GA），選擇差異最顯著的2個(gè)峰分別為x、y軸做聚類分析和ROC曲線分析，建立診斷模型。將所有標(biāo)本按2∶1隨機(jī)分組，訓(xùn)練組60例（EC患者35例，良性病變25例），驗(yàn)證組30例（EC患者18例，良性病變12例）；用訓(xùn)練組建立診斷模型，用驗(yàn)證組驗(yàn)證診斷模型的敏感性、特異性及診斷效率。

2 結(jié)果

2.1 2組血清蛋白質(zhì)圖譜比較分析

ClinProTools軟件分析發(fā)現(xiàn)2組指紋圖譜峰值強(qiáng)度存在明顯差異，分析范圍為1000～10 000 Da，共得到124個(gè)差異峰，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白峰47個(gè)（P<0.05），聯(lián)合ROC曲線分析篩選出AUC>0.80的差異峰14個(gè)，差異表達(dá)情況見表1。其中EC組表達(dá)上調(diào)的蛋白有7個(gè)，m/z分別為2482.62、2661.8、2863.7、2953.39、3242.22、5906.2、6091.35 Da；EC組表達(dá)下調(diào)的蛋白有7個(gè)，m/z分別為 1692.5、1779.63、1866.76、2211.14、7924.86、8142.99、9433.76 Da。m/z為 1779.63和 1866.76 Da的2個(gè)蛋白峰差異性最顯著（圖1），ROC曲線分析 AUC分別為 0.935和0.969，且EC組m/z 1779.63和1866.76 Da的平均峰下面積明顯低于良性病變組（圖2）。

2.2 EC診斷模型的建立及驗(yàn)證

ClinProTools軟件分析數(shù)據(jù)，用訓(xùn)練組（60例）指紋圖譜建立GA模型。分別以m/z 1779.63和1866.76 Da為x、y軸進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示2組血清標(biāo)本基本無交叉，可顯著區(qū)分EC患者和良性疾患者，交叉驗(yàn)證能力為93.77%，識(shí)別能力為96.43%。將驗(yàn)證組（30例）指紋圖譜導(dǎo)入診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示驗(yàn)證組中18例EC患者正確判斷16例（圖3A），驗(yàn)證組中12例良性病變患者正確判斷11例（圖3B），則該診斷模型的敏感性88.89%，特異性為91.67%，診斷效率為90%。

3 討論

目前EC的診斷主要依賴于影像學(xué)和組織病理學(xué)。經(jīng)陰道超聲檢測(cè)方便、無創(chuàng)，是EC早期篩查、診斷的首選方法，但診斷的靈敏度和特異性易受子宮內(nèi)膜厚度的影響。據(jù)報(bào)道，陰道超聲檢測(cè)EC及其癌前病變的靈敏度/特異度分別為87.5%/80.1%[3]。診斷性刮宮術(shù)是診治子宮內(nèi)膜異常的經(jīng)典術(shù)式，其診斷EC和非典型增生的靈敏度可達(dá)83.75%[4]，但該操作為盲視操作，若遺漏病灶則耽誤病情；此外其為有創(chuàng)性檢查，患者疼痛負(fù)荷大，選用時(shí)須綜合考慮。

表1 EC組和良性病變組血清蛋白表達(dá)情況分析

圖1 2組患者血清蛋白指紋圖譜（峰值強(qiáng)度）

圖2 差異蛋白峰下面積及ROC曲線

圖3 GA診斷模型及驗(yàn)證結(jié)果

較為常用的婦科腫瘤標(biāo)志物如CA125和HE4在診斷子宮內(nèi)膜疾病方面并不具優(yōu)勢(shì)。Jiang等[5]發(fā)現(xiàn)CA125雖在EC患者血清中升高，但不能單獨(dú)用于EC的診斷。可見目前EC的早期篩查、診斷仍然缺乏安全、有效、特異的方法。因此，尋找新的早期篩查診斷的血清學(xué)指標(biāo)尤為迫切。

MALDI-TOF MS作為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的先進(jìn)技術(shù)，無須蛋白純化，少量樣本即可直接快速、高通量分析多種生物學(xué)信息，進(jìn)行潛在標(biāo)志物的篩選、鑒定，已廣泛用于卵巢癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]、腦腫瘤[9]等多種腫瘤標(biāo)志物的篩選和鑒定。MBWCX表面積大，吸附能力強(qiáng)，可以選擇性富集、純化低豐度蛋白和多肽，與MALDI-TOF-MS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，為篩選高敏感性、特異性的潛在血清學(xué)標(biāo)志物提供了一個(gè)新技術(shù)平臺(tái)。

本研究應(yīng)用MB-WCX對(duì)EC患者和良性病變血清中低豐度蛋白進(jìn)行富集，然后通過MALDITOF MS技術(shù)篩選出m/z為1779.63和1886.76 Da的2種顯著差異蛋白，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)2種蛋白在診斷EC和子宮內(nèi)膜良性疾病上價(jià)值較高，AUC分別為0.935和0.969。以這2種蛋白建立的診斷模型診斷EC和良性病變的敏感性和特異性分別可達(dá)88.89%和91.67%，診斷效率為90%。Dong等[10]在CA125和HE4聯(lián)合診斷EC研究中指出，2種指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷EC的敏感性為73.2%，ROC曲線分析AUC為0.819。另外，Huang等[11]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，CA125和HE4聯(lián)合應(yīng)用診斷EC的敏感性和特異性分別為66%和92%，AUC為0.86。與之相比，本研究建立的診斷模型有較高的敏感性和診斷效率，提示該診斷模型可用于輔助診斷、鑒別診斷EC和子宮內(nèi)膜不典型增生。

有研究表明，50%未經(jīng)治療的子宮內(nèi)膜非典型增生患者將于10年內(nèi)發(fā)展為EC[12]。因此，有學(xué)者推薦在具有EC高危因素的無癥狀人群中進(jìn)行EC及癌前病變的早期篩查，但目前尚無特異的血清學(xué)篩查指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選取初診的EC患者和子宮內(nèi)膜良性病變患者進(jìn)行研究，共篩選出14個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白峰，與子宮內(nèi)膜非典型增生患者相比EC患者血清中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的各有7個(gè)。其中m/z為1779.63和1886.76 Da的蛋白差異最為顯著，有望成為EC及癌前病變?cè)缙诤Y查、鑒別診斷的潛在腫瘤標(biāo)記物。

綜上所述，本研究建立的EC血清學(xué)診斷模型有較高的敏感性和特異性，適用于具有EC高危因素的無癥狀人群及癌前病變的早期篩查和輔助診斷。篩選出的2個(gè)差異蛋白有望成為EC早期篩查、診斷的潛在腫瘤標(biāo)記物。但差異蛋白尚須通過液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步鑒定，以明確其生物學(xué)特性及在EC發(fā)病中的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)由于樣本量有限，結(jié)果可能存在偏倚。后續(xù)研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，細(xì)化分組，并結(jié)合臨床病理特征進(jìn)行深入分析。