miR-146a調控PI3K/Akt信號通路促進心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡

程璐 ，時學昆 ，張超 ，姜少燕 ，蔣琪

青島大學 附屬心血管病醫院 a.老年心血管病科；b.介入科；山東 青島 266000

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）簡稱心衰，是心血管等心臟疾病發展的終末階段，因心肌梗死、炎癥、血流動力學負荷過重等引起心肌損傷，造成心室重構，導致心臟收縮功能異常，使心室泵血及充盈功能下降，無法將靜脈回流的血液排出心臟，并造成動脈血液供應不足，進而引發心衰[1-3]。miR-146a是近年發現的一種非編碼的微小RNA（miRNA），據Fabiola等[4]報道，miR-146a在心衰患者的血管內皮細胞中呈高表達狀態，但miR-146a在心力衰竭中的具體作用機制尚未明確。在此，我們使用miR-146a抑制劑腺病毒轉染心力衰竭大鼠，觀察對心力衰竭大鼠的影響，并探討其可能機制。

1 材料和方法

1 材料

8周齡雄性SPF級SD大鼠，體重290～310 g，購自北京維通利華實驗動物技術公司［許可證號：SCXK（京）2012-0001］。

miR-146a抑制劑腺病毒及陰性對照（未攜帶miR-146a抑制劑腺病毒）購自深圳百恩維生物科技有限公司；HE染液、分化液、返藍液購自Ser?vicebio公司；TUNEL試劑盒購自Roche公司；Taq Man Universal PCR Mix、TaqMan microRNA As?say、Power SYBR green PCR master mix購自大連寶生物公司；逆轉錄試劑購自Promega公司；Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體購自 Santa Cruz公司；GAP?DH抗體購自廣州瑞博奧生物科技有限公司；BCA試劑盒購自Thermo公司；RIPA裂解液購自碧云天公司；SDS-PAGE電泳液購自上海信裕生物技術有限公司。

植入型動物起搏器購自上海復旦大學電子工程系；多道生理信號采集處理系統購自成都儀器廠；呼吸機購自成都泰盟科技公司；超聲診斷儀購自西門子公司；脫水機、包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；光學顯微鏡、成像系統購自尼康公司；離心機購自Heraeus公司；電泳儀、轉膜儀/穩壓電源購自Bio-rad公司；熒光定量PCR儀購自ABI公司；紫外分光光度計、酶標儀、超低溫冰箱等購自Thermo公司。

1.2 心力衰竭大鼠模型制備

參考文獻[5]建立心力衰竭大鼠模型。大鼠固定于手術臺，腹部及胸腔手術部位剃毛并消毒后進行麻醉，常規無菌操作，腹部正中行3 cm切口，將起搏器固定于腹腔內壁上，并逐層縫合腹部切口。將導線引至胸骨左緣第5肋間處，氣管插管并進行機械輔助通氣，于胸骨左緣第5肋間處行開胸術，暴露心臟后將心包撕開，將導線固定于右心室心尖部，用慶大霉素注射液沖洗胸腔后分層縫合胸腔，待大鼠恢復呼吸后拔出氣管插管并縫合頸部切口。術后應用7 d抗生素防止感染，常規飼養。術后7 d以550/min起搏頻率持續起搏4周，其中6只大鼠不進行起搏處理，觀察大鼠的行為表現及體征。起搏后期大鼠的心率加快、心腔擴大、心臟體積增大、心室壁變薄、心臟重量增加，且活動量減少、毛色干枯、飲食量減少、睡眠增加，判定心力衰竭大鼠造模成功。

1.3 實驗分組

將6只不進行起搏處理的大鼠作為假手術組（A組），將心力衰竭造模成功的大鼠隨機分為模型組（B組）、miR-146a抑制劑組（C組）、未攜帶miR-146a抑制劑腺病毒組（D組），每組6只。向C組大鼠左心腔內注射1×1012μg/mL攜帶miR-146a抑制劑腺病毒200 μL，夾閉主動脈10 s，使病毒經冠狀動脈均勻轉染至大鼠的心肌組織，其余操作同1.2，詳細步驟參考文獻[6]。D組大鼠注射未攜帶miR-146a抑制劑的腺病毒200 μL。處理7 d后麻醉并處死觀察。

1.4 qRT-PCR測定心力衰竭大鼠心肌中miR-146a表達水平

處死大鼠，取出心臟，用0.9%的氯化鈉注射液清洗后于-80℃冰箱中保存。取左心室心肌組織，滴加TRIzol溶液后進行研磨，待細胞充分裂解后加入氯仿提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參，特異性擴增cDNA。miR-146a上游引物為5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3'，下游引物為5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3'；GAPDH上游引物為5'-GAGGACCAGGTTGTCTCC TG-3'，下游引物為5'-GGATGGAATTGTGAGGGA GA-3'。PCR 反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 min，40 個循環。用 2-ΔΔCt方法進行數據整理。詳細步驟參考文獻[6]。

1.5 心臟超聲心動圖測定大鼠心功能

停止起搏后用小動物超聲成像系統測定心力衰竭大鼠的左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），取連續3個心動周期的平均值并記錄。

1.6 HE染色觀察心力衰竭大鼠心肌的病理學改變

石蠟切片常規脫蠟至水，切片入蘇木精染液染3～5 min，分化液分化，沖洗，返藍液返藍，沖洗，酒精脫水后伊紅染液中染色5 min，無水乙醇脫水，中性樹膠封片后進行圖像采集。細胞核呈藍色，細胞質呈紅色。

1.7 TUNEL法測定心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡

采用熒光TUNEL法測定心力衰竭大鼠左心室游離壁的組織心肌細胞凋亡。進行石蠟包埋，用TUNEL試劑盒進行脫蠟、水合，待細胞通透后加入TdT和dUTP，DAPI復染后加入抗熒光淬滅劑，封片。經熒光染色后凋亡的細胞在熒光顯微鏡下呈綠色，藍色為正常細胞，每張切片尋找5個視野，記錄其平均值。凋亡率（%）=×凋亡細胞數/（凋亡細胞數+正常細胞數）×100%。

1.8 Western印跡檢測心力衰竭大鼠心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9的表達

用含有蛋白酶抑制劑的裂解液將心肌組織于4℃裂解1 h，提取心肌組織總蛋白并測定其濃度，SDS-PAGE后轉至PVDF膜，麗春紅染色后溫室封閉60 min，加入一抗，溫室孵育1 h，回收一抗并用TPBS漂洗，加入二抗，溫室孵育1 h，回收二抗后漂洗，加入ECL發光試劑檢測，曝光后拍照，用Image J軟件分析。詳細步驟參考文獻[6]。

1.9 統計學檢驗

應用SPSS19.0軟件進行統計分析，數據用x±s表示，2組間比較使用獨立t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心力衰竭大鼠心肌組織中miR-146a的表達水平

與A組比較，B組大鼠心肌組織中miR-146a的表達水平明顯上調（P<0.05）；C組大鼠心肌組織中miR-146a的表達水平明顯較B組下調（P<0.05）。說明miR-164a在心力衰竭大鼠心肌中呈高表達狀態，且攜帶miR-164a抑制劑的腺病毒已轉染至心力衰竭大鼠的心肌組織（圖1）。

2.2 miR-164a對心力衰竭大鼠大鼠心功能的影響

圖1 心力衰竭大鼠心肌組織miR-146a的表達水平

與A組比較，B、C組大鼠LVEF、LVFS明顯下降（P<0.05）；C組大鼠LVEF、LVFS明顯較B組上升（P<0.05），說明miR-164a抑制劑可明顯改善心力衰竭大鼠的心功能（表1）。

2.3 心力衰竭大鼠心臟病理組織學改變

HE染色結果顯示，A組大鼠心室前壁心肌細胞排列正常，輪廓清晰，且心肌細胞形態正常，無明顯病理改變；B組大鼠心室前壁心肌細胞排列雜亂，心肌細胞水腫，周圍有炎性細胞浸潤，甚至出現質間充血、心肌纖維排列紊亂等，細胞核出現固縮或碎裂，壞死心肌出現纖維肉芽增生，纖維化程度明顯，與D組相似；C組大鼠心肌纖維排列紊亂程度較輕，細胞形態明顯較B組好，僅出現少量炎癥細胞浸潤，纖維組織也明顯較B組少（圖2）。

2.4 miR-146a對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果顯示，A、B、C、D組大鼠心肌細胞凋亡率分別為2.33%±0.98%、42.37%±6.10%、11.90%±1.90%、40.80%±6.29%，C組心力衰竭大鼠心肌細胞的凋亡率明顯較A組高（P<0.05），較B組低（P<0.05）。說明心力衰竭大鼠心肌細胞出現明顯的凋亡，而miR-146a抑制劑可抑制心力衰竭大鼠心肌細胞的凋亡（圖3）。

2.5 miR-146a對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達的影響

表1 miR-146a對心力衰竭大鼠大鼠心功能的影響

圖2 心力衰竭大鼠心臟病理組織學改變（HE染色，×100）

Western印跡結果（圖4）顯示，C組大鼠心肌細胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的表達水平明顯較B組下調（P<0.05），但仍然較A組上調（P<0.05）。說明心力衰竭大鼠心肌細胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表達明顯上調，而miR-146a抑制劑能明顯下調心力衰竭大鼠心肌細胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達。表明抑制miR-146a可抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡。

2.6 miR-146a對心力衰竭大鼠PI3K/Akt信號通路的影響

Western印跡結果（圖5）顯示，3組大鼠心肌細胞中PI3K、Akt蛋白的表達水平無明顯差異（P>0.05），但C組大鼠PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平明顯較B組高（P<0.05）、較A組低（P<0.05）。說明miR-146a抑制劑可明顯激活PI3K/Akt信號通路。

3 討論

圖3 miR-146a對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

圖4 miR-146a對心力衰竭大鼠Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達的影響

圖5 miR-146a對心力衰竭大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達的影響

心臟收縮及舒張功能異常致使心臟排血無法滿足機體需求，進而引發患者心力衰竭，是多數心血管疾病的終末表現，也是心血管疾病致死的主要原因，已逐漸得到醫學界的重視[7]。近年來，大量研究發現miRNA在心力衰竭相關疾病的發展中有重要作用[8]。例如，miR-133及miR-30在肥厚心肌中的表達下降，導致調控纖維化過程的結締組織生長因子（CTCF）表達升高，促進心肌纖維化[9]；miR-133通過抑制Caspase的表達，發揮其抑制心肌細胞凋亡的作用[10]；miR-21在缺氧心肌細胞中的表達明顯上調，與心肌細胞的凋亡及再灌注損傷密切相關[11]。趙思嘉等[12]發現，miR-146a在自身免疫性心肌炎（EAM）大鼠心肌組織中的表達明顯上升，而miR-146a agomirs（拮抗劑）可顯著降低EAM大鼠心臟炎的癥狀，大鼠的心功能也得到明顯改善。但目前關于miR-146a與心力衰竭的相關報道較少，本研究初步探索了miR-146a在心力衰竭大鼠心肌細胞中的表達及對心肌細胞的影響，并探討了其可能機制。

冠狀動脈結扎、心肌毒藥、主動脈瓣撕裂等所致的心衰模型會導致模型動物出現缺血面積過大（或過小）、病死率過高；而右心室快速起搏建立的心力衰竭大鼠模型，病死率較小，且模型動物的血流動力學及病理改變與人類慢性心衰較相似[5]，因此本研究使用右心室快速起搏建立心力衰竭大鼠模型。研究中共建立心力衰竭大鼠26只，其中3只死亡，5只用于解剖驗證心力衰竭大鼠模型心室結構的改變。結果顯示，心力衰竭模型組大鼠心肌組織中miR-146a呈高表達；心功能明顯下降；心臟出現明顯的病理性改變，心室前壁心肌細胞排列雜亂，有大量炎性細胞浸潤，甚至出現質間充血，細胞核固縮或碎裂，纖維化程度明顯；心肌細胞凋亡率增加；凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達明顯增加。表明心力衰竭大鼠模型建立成功。

心力衰竭建模成功的大鼠進行miRNA-146a抑制劑轉染，轉染miRNA-146a抑制劑的大鼠心肌組織中miR-146a顯著下調，心功能明顯較模型組好轉，心肌纖維排列紊亂程度及細胞形態明顯較模型組好，僅出現少量炎癥細胞浸潤，纖維組織也明顯較模型組少，心肌細胞凋亡率明顯較模型組下降，凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達亦明顯較模型組減少。提示miRNA-146a抑制劑轉染成功，且miRNA-146a抑制劑可明顯改善心力衰竭大鼠的心功能及心臟的病理結構，并抑制心肌細胞凋亡。

為了進一步研究心力衰竭大鼠中miRNA-146a的發病機制，本研究檢測了PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達。Western印跡顯示，PI3K、Akt在假手術組、模型組及轉染miRNA-146a抑制劑大鼠心肌組織中的表達無明顯差異，但是轉染miRNA-146a抑制劑大鼠的p-PI3K、p-Akt明顯較模型組高。提示miRNA-146a可能通過抑制PI3K/Akt信號通路促進心力衰竭大鼠心肌細胞的凋亡。因為心力衰竭的主要特征之一就是心肌細胞的凋亡，且該過程受多種凋亡因子調控，可通過調控下游多種蛋白，參與細胞的生長、凋亡等過程，而PI3K/Akt是體內一條重要的抗凋亡促增殖的信號轉導通路[13]。Zhang[14]等研究顯示PI3K/Akt通路在機體受到心肌缺血再灌注損傷時被激活，磷酸化的PI3K、Akt會與下游多個靶點相互作用，抑制心肌細胞凋亡，發揮對心肌的保護作用，而上調該信號可明顯減少心肌細胞的凋亡。大量研究[14-16]表明，miRNA可通過調控PI3K/Akt信號通路影響細胞的增殖與凋亡。

綜上所述，心力衰竭大鼠心肌組織miR-146a表達明顯上調。miR-146a可能通過激活PI3K/Akt信號通路發揮其促進心肌細胞凋亡的作用，促進疾病的發生與進展。