細菌人工染色體微球技術對微缺失/微重復綜合征的產前診斷

李一平，任華

西安市大興醫院婦產科，陜西 西安 710016

出生缺陷已成為影響兒童健康和出生人口素質的重大公共衛生問題，其中染色體疾病是嬰幼兒出生缺陷的重要原因。傳統的染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標準”[1]，可準確檢測胎兒染色體數目異常及倒位、易位等結構異常，但該技術培養周期長、操作要求高、易失敗，對5Mb以下的染色體缺失/重復無法正確檢出。事實上，這些缺失/重復往往會導致復雜的臨床表現，如生長發育異常、智力遲緩、特殊面容、內臟器官畸形、內分泌異常、精神行為改變等[2,3]。微缺失/微重復綜合征出生后診斷相對容易，但幾乎沒有有效的治療方法。因此，產前診斷的臨床意義重大。細菌人工染色體微球技術(bacterial artificial chromosomes-on-beads，BoBs)無需細胞培養、高通量，能夠快速檢測5種常見的染色體非整倍體(13、18、21、X和Y染色體)異常及9種微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征、Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征及DiGeorge綜合征)，提供了更豐富的信息，提高了產前診斷效率。本文對1 549份羊水進行BoBs快速檢測，探討其在微缺失/微重復綜合征檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月至2019年2月在西安市大興醫院因具有產前診斷指征行羊水穿刺的孕婦1 549例，平均年齡(30.06±5.02)歲，平均孕周(21.90±3.90)周。孕婦的產前診斷指征包括：高齡(≥35歲)；超聲異常；無創產前檢測高風險；血清學篩查高風險；不良孕產史；其他(家族遺傳病史、夫妻一方染色體異常等)。所有孕婦均簽署產前診斷知情同意書，行染色體核型分析及BoBs檢測，如遇微缺失/微重復綜合征，樣本增加熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)或染色體微陣列分析(chromosomemicroarray analysis，CMA)檢測。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 常規超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取羊水30 mL，15 mL用于細胞培養，10 mL用于DNA提取，5 mL用于FISH檢測。

1.2.2 染色體核型分析 15 mL羊水按照常規方式進行細胞培養、收獲、制片、G顯帶，每例樣本計數30個分裂相，分析3～5個核型。發現染色體異常或多態性變異時，計數50個分裂相并適當增加分析的核型數。

1.2.3 BoBs檢測 10 mL羊水2 000 r/min離心10 min，棄上清，利用QIAamp?DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)提取基因組DNA。按照Prenatal BACs-on-BeadsTM試劑盒(美國Perkin Elmer公司)說明書對DNA進行標記、純化、與BoBs探針雜交過夜及報告分子鏈霉親合素-藻紅蛋白結合，洗滌后Luminex?200TM讀取信號強度，BoBsoft?2.0軟件進行結果分析。

1.2.4 CMA檢測 樣本DNA利用Affymetrix公司CytoScan 750K芯片檢測基因組DNA拷貝數變化、單親二倍體及雜合性缺失等，Chromosome Analysis Suite(ChAS)軟件進行結果判讀。

1.2.5 FISH檢測 5 mL羊水行細胞處理、玻片處理、變性雜交、洗片、復染后于熒光顯微鏡下觀察。每例樣本隨機計數至少50個細胞，如果無法判讀則擴大計數。FISH探針及試劑盒由北京金菩嘉醫療科技有限公司提供。

2 結果

2.1 BoBs技術對微缺失/微重復綜合征的檢出情況 1 549份羊水中BoBs共檢出微缺失/微重復綜合征8例，檢出率為0.52%。其中Xq27.3缺失綜合征1例，7q11.2重復綜合征1例，Xp22.31缺失綜合征2例，18p11.32p11.21重復綜合征1例，8q23.3缺失綜合征1例，4p16.3重復綜合征1例，22q11.2缺失綜合征1例，見圖1。22q11.2缺失綜合征進行FISH驗證，其余綜合征CMA進行驗證，結果均與BoBs一致。

圖1 BoBs檢測的微缺失/微重復綜合征

2.2 染色體核型分析對微缺失/微重復綜合征的檢出情況 染色體核型分析只檢出缺失/重復3例，其中缺失/重復區域均在10 Mb左右，見表1。病例1：孕婦因血清學21三體篩查高風險行羊水穿刺，核型結果為46，XX，del(X)(q27.3_q28)，BoBs結果顯示46XX，Xq27.3缺失，CMA結果發現Xq27.2q28(140 508 944_155 233 098)區域出現14.7Mb缺失；病例4：染色體核型分析發現標記染色體存在，不確定其來源，BoBs結果顯示46XX,18p11.32p11.21重復，CMA驗證發現18p11.32p11.21(136 285_15 143 614)x4：15Mb，即18號染色體p11.32p11.21區域存在15Mb重復，為18p四體綜合征，其重復區域涉及SMCHD1、LPIN2、TGIF1等重要基因，可能導致發育遲緩、智力障礙、心臟及腎臟異常等嚴重問題；病例6：因21三體風險值1/109于孕19周行羊水穿刺，核型結果為46，XX，del(8)(q23.1q23.3)，BoBs結果發現8q23.3區域存在缺失，隨后CMA檢測精確定位發現8號染色體q23.1q23.3區域缺失9.4Mb，該缺失區域包含TRPS1、EMC2、TRHR、NUDCD1、SYBU等13個OMIM基因，診斷該胎兒為TRPSⅠ型綜合征，孕婦在染色體核型分析、BoBs和CMA檢測結果均異常并進行遺傳咨詢后選擇終止妊娠，引產下胎兒可見明顯異常，如毛發稀疏、梨狀鼻、小下頜、短趾畸形等。

表1 8例微缺失/微重復綜合征的檢測結果

3 討論

目前，染色體疾病尚無有效地治療方法，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔，唯一可采取的途徑是盡早進行遺傳咨詢及產前診斷。染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標準”，但其分辨率低，對5 Mb以下的染色體缺失/重復很難正確檢出，可能存在一定的漏檢風險。與傳統染色體核型分析相比，BoBs技術無需細胞培養、快速、高通量、準確性高，除了檢測5種染色體非整倍體外，還可對9種常見的微缺失綜合征進行檢測，同時其覆蓋的探針是已知疾病的關鍵區域，結果明確，易于解讀，提高了產前診斷的效率，降低了遺傳咨詢的難度[4-5]。LI等[6]、HUANG等[7]研究發現，BoBs技術除了準確檢出所有的染色體非整倍體，同時對微缺失/微重復綜合征的檢出能力明顯優于染色體核型分析，是一種可選擇的穩定準確的新技術。

本研究利用BoBs技術對1 549份羊水進行快速檢測，共發現微缺失/微重復8例，檢出率為0.52%，其中微缺失綜合征5例，微重復綜合征3例，同時產前BoBs結果與FISH、CMA驗證結果完全一致，體現了該技術在微缺失/微重復綜合征檢測方面具有較高準確性及可靠性。此外，染色體核型分析僅檢出3例，且缺失/重復區域均在10 Mb左右，聯合BoBs技術擴大了0.32%的檢出率，避免了一定的假陰性結果。本研究中微缺失/微重復的檢出率較國內外報道偏低[8-9]，可能與微缺失/微重復綜合征本身的發病率較低有關，其次目前檢測的樣本量不夠大，可能存在一定范圍的誤差。

近年來，隨著多重連接依賴探針擴增技術(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)、熒光定量聚合酶鏈式反應(QF-PCR)、FISH、CMA、BoBs等技術在臨床上的廣泛應用，越來越多的微缺失/微重復綜合征胎兒被發現[10-14]。目前臨床上可作為微缺失綜合征預測的產前高危因素包括特征性臟器畸形(主要為心臟畸形)；宮內發育遲緩/姿態異常；羊水過多/過少；父母之一有明確微缺失綜合征等。因此，當遇到染色體核型分析結果正常，應密切關注后期超聲結果，一旦超聲診斷異常，需考慮進行下一步檢測排除微缺失/微重復等，必要時盡可能對胎兒父母樣本進行分析，這對于染色體變異來源確定具有重要意義[15]。

綜上所述，BoBs技術是一種敏感、可靠的檢測技術，由于覆蓋了更多疾病，對傳統的染色體核型分析進行了很好地補充和完善，在提高染色體異常檢出率的同時縮短了檢測時間，適合大量樣本的快速處理，值得在臨床中廣泛推廣及應用。