銀蓮花素A對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠自噬的調(diào)控作用及機(jī)制研究①

楊 瀅 李作孝 (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,瀘州 646000)

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是一種典型的自身免疫性神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病特征為外周促炎細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并導(dǎo)致多灶性炎性脫髓鞘。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)是MS的理性動物模型。在自身免疫過程中，細(xì)胞自噬與固有免疫及適應(yīng)性免疫緊密關(guān)聯(lián)，有研究顯示細(xì)胞自噬直接參與MS或者EAE的進(jìn)展[1]。銀蓮花素A(raddeanin A，RA)，又名竹節(jié)香附素A，是中藥兩頭尖提取出的三萜皂苷，近來研究證明其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬等作用[2]。RA對胃癌SGC-7901細(xì)胞的研究中，通過透射電鏡觀察及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測，顯示RA可能通過調(diào)控p38MAPK/mTOR通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬實現(xiàn)抗腫瘤作用[3]。本研究通過觀察RA對EAE小鼠發(fā)病情況、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白以及p38MAPK、mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)變化的影響，探討其對EAE小鼠自噬的調(diào)控及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 C57BL/6小鼠60只，體重18～22 g，周齡6～8周，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物房。將小鼠隨機(jī)分為空白對照組、EAE模型組及RA低、中、高劑量組，每組12只。

1.1.2藥品及主要試劑 竹節(jié)香附素A(中國食品藥品檢定研究所)，MOG35-55多肽(上海吉爾生化有限公司)，結(jié)核分枝桿菌H37Ra(上海瑞楚生物科技有限公司)，百日咳毒素(美國sigma公司)，Luxol Fast Blue染液試劑盒(ASPEN公司)，DAPI染液(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)，兔抗小鼠p-p38抗體、兔抗小鼠多克隆微管相關(guān)蛋1輕鏈3B(LC3B)抗體(CST公司)，兔抗小鼠 p-mTOR、p-p70S6K抗體(abcam公司)，山羊抗兔HRP(ASPEN公司)。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備及處理 將MOG35-55溶于PBS(0.01 mmol/L)，濃度為2 mg/ml，TB溶于CFA，濃度為10 mg/ml[4]。……