納米細菌在骨關節疾病中的研究進展

彭偉秋，張祥洪

(廣西科技大學附屬柳州市人民醫院關節骨病科，廣西 柳州 545006)

納米細菌(nanobacteria NB)是時20世紀80年代Kajander等發現并命名以來，在生命科學領域引起了科學家們廣泛的研究熱情，是近30年來飽受關注和爭議的研究課題[1]。研究者對NB的關注主要有三個方面：其一認為NB分布廣泛，可感染任何生物組織和細胞，具有較大的毒性。NB可能是地球上最小的細胞形式，也可能是地球和地外細胞生命起源的細胞前體[2]。其二認為NB與人類病理性鈣化類疾病和結石類疾病密切相關,生物體內的結石和病理鈣化性組織內都可以檢測出NB的存在，NB可能是引起這些疾病的病原體[3]。其三是動物實驗中利用NB已經成功研制出膽囊結石和腎結石的動物模型，并用這些動物模型開始結石類疾病的形成機制和治療方法探討[4-5]。對NB爭議的焦點是截然不同的兩個方面：支持者認為NB是一種新型的微生物，屬革蘭陰性菌,呈球狀或球桿狀,體積極小，基因序列分析表明NB含16SrRNA序列[6]。Martel等反對者卻認為NB不是一種新型的微生物，現有生物體的所必須的大分子蛋白和DNA的體積最小直徑必須至少在200納米以上，NB體積太小不可能容納這些大分子物質，多聚酶鏈反應檢測沒有發現NB中有確定DNA或RNA[7-9]。

盡管關于NB是否是微生物的爭議還在繼續，但是NB與人類結石類疾病和病理性鈣化類疾病的相關性探索研究一直是研究熱點。骨是人體內主要鈣化組織，近年來的一些研究發現表明，NB可能與人的骨質疏松癥、骨性關節炎和類風濕關節炎等骨科疾病發生有關，NB與骨科疾病的一些相關性研究也引起大家的關注。本文擬從NB的特性以及NB在骨科疾病中的作用進行綜述。

1 NB特性

1.1NB生物特性：Kajander等認為NB是一種新發現的古老生物，屬革蘭陰性菌,呈球狀或球桿狀,細胞壁厚,無莢膜與鞭毛結構[1]。NB體積極小,約50～500 nm,可通過直徑<0.1 μm的細菌濾膜,高分辨率的原子顯微鏡可檢測到NB菌體周圍有羥基磷灰石碳酸鹽結晶外殼。NB耐高溫和強酸，普通的微生物培養和檢測不適用于NB,必須用細胞培養方式和特殊檢測方法。NB生長非常緩慢,每次分裂增殖周期約3～6 d。PCR基因序列分析認為NB與α2亞群的布魯菌和巴爾通體菌屬具有相似的16SrRNA序列。

Martel等認為NB雖然具有一些仿生物特性，但NB不是活的生物體，而是一種鈣化的納米顆粒(calcifying nanoparticles CNPs)[10]。Young等認為CNPs是生物體內鈣穩態調節的生理性殘留物和細胞培養的副產品[11-12]。CNPs主要由白蛋白、胎蛋白-A和載脂蛋白A1與鈣和其他離子的結合形成有機礦物復合物。免疫印跡實驗顯示特定于NB的抗體與白蛋白、Fetuin-A都有反應；在含有血清的細胞培養基中加入析出的鈣離子時可快速形成在形態學和化學上都與NB相同的礦化有機納米顆粒CNPs。生理狀態時，人體液內的Fetuin-A和少量白蛋白是納米顆粒形成的抑制劑。病理條件下，Fetuin-A和白蛋白的抑制納米顆粒形成由于各種原因減弱時，不但不能抑制納米顆粒形成，還與鈣或磷灰石結晶以某種方式結合，在體液中形成所謂的NB。這些CNPs可以在含血清的培養液中生長、增多，類似單細胞生物的生長，分裂和傳代培養。

1.2NB的致病性：Hjelle等認為NB可感染任何生物體的組織細胞，具有細胞毒性[13]。人體感染NB后不能將NB徹底清除，普通的試驗方法不能檢測診斷，對細菌有效的常用抗生素對NB無效，臨床上常用的化學消毒措施也不能殺滅NB。NB在感染的細胞內生長繁殖數目大于100個細菌時可引起細胞凋亡；NB的毒性分泌物為鈣化的脂多糖,它可以殺死T-6淋巴細胞，也可刺激感染組織和細胞發生炎性反應因子反應,介導炎性反應因子形成和分泌增加，最終引起被感染細胞死亡和組織病理性鈣化；NB周圍形成的鈣化生物膜,機體的免疫細胞不能識別,NB依靠自己鈣化外殼的保護可以在生物體內長期存在。

Wong等認為NB不是致病微生物，而是鈣化的有機納米微粒CNPs，低濃度的CNPs在生理狀態下沒有毒性和致病性，高濃度的CNPs可以引起和加速細胞凋亡[14]。CNPs具有生物細胞生長、發育和傳代繁殖的特性。生理狀態下，CNPs參與骨骼和牙齒發育，是骨組織和牙組織的生理性鈣化前體成份，CNPs還是腸道細菌和食物抗原的礦化免疫耐受機制形成的參與者。Shook等認為病理狀態時，CNPs不但在異位鈣化和腎結石中可以檢測到，還在心血管疾病，慢性腎病和特發性早產兒也發現有CNPs參與相關[15]。NB的這一特性可為我們防治病理性鈣化提供新方法。

1.3NB的分離、培養與檢測：NB的分離常用濾膜濾菌法。該法取含NB標本溶液用0.22 μm濾膜反復過濾離心后取濾液培養。NB培養時需要使用胎牛血清,培養需在溫度為37℃,含5%～10%CO2培養箱中進行。NB的檢測有電鏡下觀察法，免疫熒光檢測法和免疫抗體檢測法。Smith 等認為PCR檢測NB結果的準確性不高[16]。

Wu等通過對人和動物的血液、唾液、尿液和關節液等體液中發現NB存在[17]。Ansari等在人腎結石、膽囊結石和口腔結石等結石中檢測到NB[18]。Richards等在心瓣膜、血管和胎盤等多種病理性的鈣化組織中發現NB的存在[19]。

2 NB與骨科疾病

2.1NB與骨質疏松：Sommer等研究艾滋病患者骨密度(Bone Minal Density BMD)的減少和腎結石的形成趨勢的相關性發現,NB可以導致BMD減少，其可能的原因是NB需要從血液中攝取鈣和磷酸鹽，影響人體內的鈣和磷酸鹽的穩態，進一步可能影響BMD而發生骨質疏松癥[20]。

張名均等研究發現NB對人成骨細胞C3H10具有細胞毒性作用，主要機制是通過促進細胞凋亡發揮細胞毒作用。同時NB能促進鈣化相關蛋白BMP-2的表達，也能引起凋亡相關蛋白Bax的表達升高，研究中羥基磷灰石對人成骨細胞C3H10無細胞毒性作用，羥基磷灰石雖然也能促進鈣化相關蛋白BMP-2的表達，但不能促進凋亡相關蛋白Bax分泌[21]。研究證實NB具有羥基磷灰石完全不一樣的特性。

郭亞楠等從鈣化的胎盤中分離和培養出NB，認為NB可感染母親的胎盤和胎兒[22]。NB感染胎盤可引起胎盤細胞結節和小葉纖維索性壞死，導致胎盤鈣化。胎盤鈣化和壞死可導致胎兒營養障礙和發育異常。NB感染胎兒可導致維生素D和鈣磷離子代謝紊亂，認為NB可能與先天性佝僂病發病有關。

2.2NB與骨關節炎：骨關節炎是骨科常見的退行性疾病，發病的因素很多，具體機制不詳。Tsuramoto等在膝骨關節炎的關節液中檢測到NB，證實骨關節炎患者存在NB，作者推測NB與骨關節炎的發病可能有關[23]。彭偉秋等發現膝骨關節炎患者的關節液中NB檢測陽性率100%，而正常膝關節的NB檢測陽性率僅為4.5%，認為二者關系密切[24]。體外實驗發現NB可以損傷軟骨細胞，NB損傷軟骨細胞時,沒有氧自由基的參與，但有一氧化氮參與，一氧化氮介導的細胞損傷可能是軟骨細胞壞死的機制。納米細菌可能與骨關節炎的發病有關,但尚須進一步加以證實。

Tsurumoto等研制出一種生物傳感器用來檢測NB，發現骨關節炎患者的滑膜液中NB陽性檢測率100%，證實NB在骨關節患者的關節液中普遍存在。但NB是否是骨關節炎的病因作者并沒有進一步研究證實[25]。

Agarwal等運用NB仿生物特性制備攜帶白細胞介素受體拮抗劑的有機納米微粒治療骨關節炎研究中，發現這些新型的自組裝納米微粒在血清溶液中具有很好的細胞相容性和穩定性，可有效避免白細胞介素受體拮抗劑被人體在短時間內清除，局部高濃度的白細胞介素受體拮抗劑可增強抗炎強度和作用時間[26]。將攜帶白細胞介素受體拮抗劑的有機納米微粒注射到骨關節炎患者關節腔內，關節間隙局部高濃度白細胞介素受體拮抗劑可阻止IL-1信號傳導至細胞介導的炎性反應，從而控制和減輕骨關節炎病情，幫助軟骨組織的再生和修復。

2.3NB與類風濕關節炎：石慶新等在探討類風濕關節炎患者和正常人群血清標本中NB分布情況時，對正常人群和類風濕關節炎患者的血清進行NB培養，用鈣染色技術對培養物進行NB檢測，采用間接免疫熒光法進行納米細菌鑒定。結果30例正常人血清NB的陽性檢出率分別為6.7%，30例類風濕關節炎患者血清NB的陽性檢出率為30.0%，提示類風濕關節炎的發病和NB感染可能有關[27]。

石慶新等用PCR技術對正常人群和類風濕關節炎患者關節液標本進行NB檢測,發現類風濕關節炎患者關節液中存在NB,認為類風濕關節炎患者發病與NB感染關系密切。PCR法可以用于類風濕關節炎患者NB感染快速檢[28]。

Tsuramoto等也報道在類風濕關節炎患者關節液中培養和檢測時發現NB存在，推測NB可能與類風濕關節炎發病有關[25]。

陳琳等認為類風濕關節炎患者呈慢性發病。年齡越大,累及的中、大關節的越多;年紀越輕,關節滑膜血管增生越多、越明顯[29]。NB與類風濕關節炎相關是不是受年齡有關需進一步研究證實。

2.4NB與骨的礦化：脊柱動物的骨和牙等礦化器官的形成機制仍是不解之謎。Olszt等在研究骨礦化形成時發現NB微粒存在，在骨形成早期,NB是大小不等的圓形礦化微粒，它們是散在依附在未骨化膠原纖維中的無定形礦化微粒，隨著骨發育，這些NB無定形礦化微粒增多融合成片，形成納米水晶礦物，增多的納米水晶礦物再融合成片形成類似平板的納米晶體，大量的納米晶體充填滿骨膠原纖維網時，骨的礦化就完成[30]。在骨形成過程中，NB的形成、增殖、融合、結晶和納米水晶平板的形成發生異常，骨的礦化可能發生異常而發生骨病。NB可能是生理性骨礦化形成時的有機礦化前體，在NB的濃度異常或調節NB的因子異常時，才可能發生病理性鈣化。

Bongio等用富含鈣磷的NB微粒的膠原蛋白水凝膠為支架，將人臍內皮細胞植入培養檢測支架的血管化變化，同時將骨髓間充質干細胞、成骨細胞和破骨細胞前體一起培養檢測支架的成骨情形。研究發現臍內皮細胞在支架上可形成一個巨大的微血管網絡，骨髓間充質干細胞分化附壁參與血管化。成骨細胞和破骨細胞前體的分化為成骨細胞和破骨細胞，二者分化速度受鈣磷的NB微粒濃度的影響，也受聯合培養的臍內皮細胞、骨髓間充質干細胞、成骨細胞和破骨細胞前體共同調節。四種細胞在富含鈣磷的NB微粒的膠原蛋白水凝膠支架中成功的培育出血管化三維骨形成模型，為骨科疾病研究提供了新方法[31]。

2.5NB與異位骨化：疾病狀態時，NB可參與異位骨化、結石類疾病和病理性鈣化，NB與異位骨化相關的研究也引人關注。Orriss等認為焦磷酸鹽可以抑制成骨細胞的異常骨化[32]。磷酸鹽-焦磷酸比微環境是骨礦化的基本調節因子，它通過影響成骨細胞分泌NPP因子影響骨化。組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)參與焦磷酸鹽分解，NPP和TNAP決定局部細胞外磷酸鹽和焦磷酸鹽水平。生理狀態下，NB是骨組織的生理性鈣化的前體成分。病理狀態時，NB參與異位骨化的形成，焦磷酸鹽作為影響生物礦化重要因子，有望成為抑制NB引起的異位骨化和病理性鈣化。

Wu等認為Fetuin-A蛋白是調節生物礦化的重要子。在低濃度鈣和磷酸鹽液體中，Fetuin-A蛋白和白蛋白也可形成納米樣顆粒，這些顆粒進一步形成紡錘體、薄膜和聚合體復合物[33]。Fetuin-A蛋白作為礦化抑制劑比白蛋白強。礦物質-蛋白質濃度較高時，Fetuin-A作為引物引導白蛋白形成NB樣復合物。在胎牛a蛋白的存在時形成的NB微粒更小，更傾向于多層環狀的形態。Fetuin-A蛋白和白蛋白形成的NB樣礦物顆粒在化學、光譜和形態學上與血清顆粒和NB相似。這些粒子可以從非晶態到晶體的轉變，蛋白質與礦物質的比例低的微粒更有利于轉化為晶體。Fetuin-A蛋白質和其他抑制因子的存在，阻礙磷灰石核的穩定形成，促使初生無定形細胞核或半晶球形納米粒子逐漸長大，合并成晶體紡錘體和薄膜。這一特性為NB的異位骨化提供了新方法。

Pasch 等認為異位鈣化患者血液中存在較高的異位鈣化病理因素[34]。由于鈣和磷酸鹽結合鈣化抑制蛋白Fetuin-A形成無定形含磷酸鈣的蛋白顆粒(CPPs)，無定形CPPs可自發轉化為含有結晶鈣的次生CPP磷酸，通過血清CPP-Fetuin-A法測定可沉積Fetuin-A的數量和T50法測定無定形CPPs轉變為結晶CPPs的時間可綜合評估異位鈣化風險，為改善全身性的鈣化傾向提供依據。

3 展望

NB發現至今，經歷了生物與非生物和致病菌與非致病菌的廣泛爭議與科學研究。最新的研究認為NB屬非生物的鈣化有機納米顆粒，具有仿生特性，在形態、生長、增殖和傳代培養特性上有著類似于細菌的生物生命形式。盡管圍繞NB的爭議還在繼續，越來越多的研究表明，這樣一個以納米級存在,可以自我復制的礦化納米顆粒具有極其大的潛在意義，它獨特的生物礦化性質,為解釋多種疾病的發生、發展提供新的依據,為我們治療疾病提供新的方案,甚至為利用生物礦化提供了材料。對研究骨組織以外組織鈣化性疾病、結石類疾病提供了納米級視野，也為納米生理學、納米毒理學和納米醫學的未來研究提供了新思路。