代謝組學技術及其在部分寄生原蟲研究中的應用

姜曉明,張 聰,趙佳琪,馮憲敏,馬愛新,孔繁利*

(1.北華大學，吉林 吉林 132013;2.吉林醫藥學院，吉林 吉林 132013)

在1999年Nicholson[1]和2000年Fiehn[2]在分別提出代謝組學的概念后，有關于代謝組學研究逐漸進入到各種研究領域，并逐漸成為各研究機構的研究熱點。代謝組學通過研究生物在新陳代謝的程中代謝產物的變化從而揭示其代謝途徑及代謝機制等。代謝組是一個生物體或其一個器官甚至一個細胞在代謝過程中產生的所有代謝產物，其分子量較小，這些分子通常在生物體生命活動中發揮重要的生物效應[3]。

1 代謝組學技術

目前對于代謝組學的研究過程的方法一般包括三個方面，即對樣品處理、處理樣本后的檢測以及對于檢測的數據分析[4]。

1.1 樣本處理技術

代謝組學的樣本最為常用的為血液和尿液，在科學研究中組織和細胞(蟲體)培養液也是其檢測的樣本。為了去除雜質代謝物采樣后一般要求對樣本進行預處理[5]。目前代謝組學樣品的預處理方法較多，常見的有液-液萃取、固相萃取(SEP)等。因SEP法能夠獲得到一些特殊的代謝產物，而其他方法一般不能達到此效果，所以SPE法是目前使用最多的處理樣本方法[6]。

1.2 樣本檢測分析技術

對于樣本的檢測目前應用的技術主要包括質譜技術(MS)、核磁共振技術(NMR)及氣相色譜技術GC和液相色譜技術LC等。而NMR和色譜-質譜聯用(GC-MS)是其最常用的技術[7]。其他新型的技術。在某些研究報道中也有應用。

1.2.1核磁共振技術

NMR技術應用廣泛其優點是重復性好，對樣本無破壞性[8]，不需要分離樣本[9]。這些優點使其成為對整個有機體體內原位研究代謝組學檢測的好方法。其缺點是靈敏度較低，這也限制了其應用[5]。近年來，隨著高分辨率核磁共振技術的發展，使其靈敏度低的不足得到改善[10]。

1.2.2色譜-質譜聯用

GC-MS的缺點是其樣品必需易揮發[5]。分辨率高、分析時間短的全二維氣相色譜(GC×GC)的應用彌補了其缺陷[11]。LC-MS靈敏度高，其痕量分析代謝產物的特點，使其在代謝組學研究中被廣泛應用[12]。高效液相色譜法(UPLC)和質譜MS聯用(UPLC-MS)提高了分辨率和重復性，未來被廣泛應用于代謝組學的潛力巨大[13]。

1.3 數據分析

代謝組學采集的數據量龐大，常規的統計分析方法不適用于其分析[14]。因此需要應用生物信息學和化學計量學的方法對數據分析處理，稱為模式識別技術，具體方法包含非監督(unsupervised)方法和有監督(supervised)方法兩種[15]。非監督方法是用主成分分析(PCA)[16]、聚類分析(HCA)[17]等方法將原始數據歸類后可視化的展示。而有監督方法的基礎是建模,在建模的基礎上用已知樣本和信息對未知數據進行歸類分析的方法。應用最廣泛的有監督方法是偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)[18]。因為有監督方法在分析前需要進行假設，因此假設的合理性關乎最后結果，至關重要。

2 代謝組學在一些寄生原蟲研究中的應用

2.1 惡性瘧原蟲

惡性瘧原蟲為寄生于人體的四種瘧原蟲之一，是造成惡性瘧疾的病原體。惡性瘧疾并發癥較多，可危及生命。其致病階段為其紅細胞內期的裂體增殖期[19]。此時宿主細胞代謝會出現異常[20]。Olszewski等[21]利用LC-MS技術，發現其糖酵解與三羧酸循環沒有相關性，另外三羧酸循環在惡性瘧原蟲出現出分支化的現象。Orikiiriza等[22]利用1H NMR技術對惡性瘧原蟲患者血漿進行檢測，其宿主脂代謝發生紊亂。Sengupta等[23]用同樣的方法發現了腦性瘧原蟲病的宿主體內糖蛋白含量出現下降的現象。

2.2 枯氏錐蟲

枯氏錐蟲的傳播媒介是錐蝽[24]，在錐蝽的消化道內寄生著錐蟲[25]。有團隊用傅里葉變換離子回旋共振質譜分析了三種不同的錐蝽的代謝，發現代謝圖譜中近80%是相近的，不同的為脂質、脂肪酸、氨基酸、類固醇、酚類等[26]。Trochin等[27]用HPLC-MS技術對枯氏錐蟲進行了代謝組學分析時加入了藥物處理，經處理后錐蟲的硫醇類化合物的水平下降了，濃度升高的是堿基濃度。相似的實驗中，Vincent等又發現糖酵解的過程受到了抑制[28]。

2.3 利士曼原蟲

利士曼原蟲可引起黑熱病，其傳播媒介為白蛉[29]。Canuto等[30]同時用了GC-MS、LC-MS和CE-MS對蟲體進行分析，發現當活性氧的產量升高時聚胺代謝受到了抑制。此原蟲前鞭毛體能夠大量累積葡萄糖，可在無糖時生存。吸收葡萄糖時葡萄糖轉運蛋白發揮重要作用，但是敲除此蛋白后，蟲體仍可存活，其感染能力下降[31]。同時，當蟲體葡萄糖轉運蛋白被敲除，會導致蟲體的多種糖代謝水平降低[32]。

2.4 剛地弓形蟲

剛地弓形蟲是嚴格的宿主細胞內寄生原蟲，所有生存所需的營養全部來自于宿主細胞[33]。以往認為宿主葡萄糖是其能量唯一來源，但當敲除其吸收葡萄糖功能的基因后仍可生存[34]。James等[35]使用氣相色譜質譜聯用技術對其進行了代謝分析。發現其可通過γ氨基丁酸分流的方式分解谷氨酰胺以獲得能量。有團隊研究弓形蟲感染會引起宿主代謝的變化，發現感染弓形蟲的小鼠體內多巴胺含量都增多[36]。弓形蟲感染還可以影響犬類的尿氨酸代謝通路[37],隨著感染的開始代謝物含量上升，應用藥物治療后，代謝物含量下降。

代謝組學以及其他新興的技術是研究寄生蟲和寄生蟲病的強有力手段。寄生蟲與其宿主之間存在太多已知和未知的錯綜代謝關聯與影響，而代謝組學則能夠從本質上揭示寄生蟲病的發生機制。廣泛及有效地利用這些研究手段，去發現其機制、研發新疫苗、改良現有的藥物是科研人員義不容辭的責任。