苦瓜提取物指紋圖譜的研究

韓在祺，張宏梅，李明星，崔佰吉,郝乘儀

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

苦瓜，別名涼瓜、癩瓜等，系葫蘆科苦瓜屬植物的果實。夏、秋季近成熟時采收，具有清熱解暑、明目解毒等功效，苦瓜藥食同源的特性和顯著的生理活性使其成為近年來人們研究的熱點[1- 3]。中藥指紋圖譜技術(shù)是目前控制中藥、天然藥等質(zhì)量最有效的方法和手段之一,符合中藥特色。此項技術(shù)不僅可以應(yīng)用于中藥材的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評價、中藥制劑生產(chǎn)工藝全過程的質(zhì)量控制和最終產(chǎn)品的質(zhì)量評價，還可應(yīng)用于藥效物質(zhì)成分鑒定和中藥藥效活性的測定[5],是保證中成藥功效、實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化進展的關(guān)鍵之一[6]。本研究采用高效液相色譜- DAD檢測法[7]，建立苦瓜提取物的指紋圖譜，為苦瓜的質(zhì)量評價提供理論依據(jù)，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供可靠方法。

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器

LC- 20AT系列高效液相色譜儀(日本島津)；CAP225D電子天平(Sartorius)；SHZ- D3循環(huán)水真空泵(予華儀器有限公司)；GSY- 2不銹鋼電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)藥設(shè)備廠)；KQ- 250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；202- 2AB型電熱恒溫干燥箱(泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試 劑

甲醇(批號：20100826)天津市永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸(批號：20120722)天津市光復(fù)精細化工研究所；乙腈(批號20111126048)山東禹城實業(yè)有限公司化工分公司；苦瓜市售；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18 色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫(0→5→15→35→50→60 min，20%→20%→45%→80%→45%→20%甲醇)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

苦瓜去籽切塊后，置于75 ℃恒溫干燥箱中完全烘干。精密稱取稱取干燥苦瓜10 g，置500 mL圓底燒瓶中，加入100 mL的80%乙醇，水浴加熱回流1.5 h，提取兩次，合并提取液，定容至200 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)研究

方法學(xué)驗證過程中，采用選取參照指紋峰的保留時間和色譜峰面積為基準(zhǔn)，其他指紋峰采取相對保留時間和相對峰面積的比較方法，分析指紋峰過程中，47號色譜峰峰型良好，分離度和理論塔板數(shù)均符合要求，所以選擇47號峰作為參照指紋峰。

2.3.1精密度實驗

取同一份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算各6次進樣下各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，主要色譜峰的相對保留時間的RSD值范圍0.17%～0.85%，相對峰面積的RSD值范圍為0.66%～1.01%，表明各主要色譜峰具有較好的一致性，系統(tǒng)的精密度良好。

2.3.2重復(fù)性實驗

取同一批次苦瓜提取物供試品6份，按“2.1”項色譜條件下分別進樣測定，以最高峰的物質(zhì)為參照峰，計算各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，主要色譜峰的相對保留時間時間及相對峰面積的RSD值范圍為0.08%～0.88%，相對峰面積的RSD值范圍為0.85%～1.65%。結(jié)果表明，系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性。

2.3.3料液比對荷葉多酚提取率的影響

取同一份供試品溶液,按“2.1”項色譜條件下以一定的時間間隔0、2、4、6、12、24 h依次進樣分析，以最高峰的物質(zhì)為內(nèi)參照物，測得各主要色譜峰的相對保留時間、相對峰面。結(jié)果顯示，主要色譜峰的相對保留時間時間及相對峰面積的RSD值范圍為0.14%～0.58%，相對峰面積的RSD值0.33%～1.55%，表明同一色譜條件下供試品溶液中主要物質(zhì)在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 共有峰的標(biāo)定

按“2.2”項下方法制備苦瓜提取物供試品10批，按“2.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012)”進行圖譜處理，生成對照色譜圖,并進行數(shù)據(jù)匹配得HPLC- DAD色譜圖中共有峰32個，以峰面積占總峰面積大于0.1%為依據(jù)，選定為強峰共找出15強峰，計算各強峰的相對保留時間的RSD值范圍為0.08%～0.98%。

2.5 指紋圖譜評價

按“2.1”項下色譜條件，對10批苦瓜提取物供試品進行分析。以10批指紋圖譜各峰均值生成對照圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012)”計算各批次樣品的HPLC- DAD指紋圖譜相似度。由實驗結(jié)果可知，各批次之間的苦瓜相似度差異比較大，相似度范圍為0.599～0.902，提示苦瓜雖然外觀顏色和外形的判斷不能體現(xiàn)出苦瓜的有效營養(yǎng)成分的差異，通過指紋圖譜的研究可以看出，各個不同產(chǎn)地的苦瓜其內(nèi)在質(zhì)量存在很大的差異。

3 討 論

指紋圖譜在應(yīng)用的過程中，往往需要確定研究過程中的具有代表性的成分作為指紋圖譜相對保留時間和相對保留峰面積的計算標(biāo)準(zhǔn)。本研究過程中進行了多種成分的檢查和對比，沒有取得合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為指紋圖譜建立過程中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，最終選擇了圖譜中具有代表性的47號峰，作為本研究的指紋圖譜的基準(zhǔn)物質(zhì)，從而對指紋圖譜的相關(guān)數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)奶幚恚沟每喙现讣y圖譜的研究更加合理化。本課題組還在繼續(xù)進行苦瓜有效成分的分離工作，在指紋圖譜技術(shù)的指導(dǎo)下，完成各有效成分的分離、純化工作，進一步完成苦瓜有效成分的保健功能的研究，進而為苦瓜指紋圖譜技術(shù)提供更有力的技術(shù)保障，為苦瓜資源的合理利用提供理論依據(jù)。