普魯卡因通過miR-15a-5p/PI3K-AKT3途徑調控乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制

馬寶豐 李鐵成 徐芳

(錦州醫科大學附屬第三醫院麻醉科，遼寧 錦州 121001)

乳腺癌發生于乳腺腺上皮組織，近年來女性乳腺癌發病率和死亡率都呈明顯上升趨勢，嚴重威脅女性健康〔1〕。據統計，2015年世界乳腺癌新發病患者約240萬例，死于乳腺癌的患者約52萬例〔2〕。外科手術治療、放化療、靶向治療、內分泌治療等多種乳腺癌臨床治療方式雖可降低患者死亡率、延長患者生存期，但治療后出現癌細胞的轉移及放化療的毒副作用是乳腺癌導致患者治療效果不佳的主要原因〔3～5〕。麻醉藥在乳腺癌手術治療中廣泛應用，現如今越來越多的研究關注于麻醉鎮痛藥物與腫瘤生長和轉移的關系，臨床研究結果顯示，曲馬多可、咖啡酸苯乙酸酯、雷諾嗪等麻醉類藥物對乳腺癌的生長和轉移具有一定的抑制作用〔6～8〕。普魯卡因(PCA)是傳統的化療藥物之一，在手術中也作為局部麻醉劑使用，在肝癌的研究中發現，PCA能夠使肝癌細胞生長阻滯在G0/G1期，從而顯著抑制癌細胞的增殖，并具有劑量、時間依賴效應〔9〕。本研究擬探討PCA對乳腺癌細胞MCF-7增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-7人乳腺癌細胞購自ATCC；胎牛血清、DMEM培養基購自美國賽默飛世爾公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；TaKaRa反轉錄試劑盒、TaKaRa實時熒光定量試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自江蘇碧云天生物技術公司；Transwell小室購自Corning公司；噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜購于美國Sigma公司；Trizol試劑、結晶紫、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；兔抗人蛋白激酶B(AKT)3多克隆抗體購自美國Abbiotec公司；兔抗人GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自Abcam公司；control mimic和miR-15a-5p mimic、control inhibitor和miR-15a-5p inhibitor購自廣州瑞博生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2細胞培養 人乳腺癌細胞MCF-7使用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，每天換新鮮培養液一次，待細胞融和至70%左右時使用胰蛋白酶消化傳代。選對數生長期的細胞進行實驗。

1.3細胞轉染與分組 生長對數期的細胞使用0.25%胰蛋白酶消化后重懸，以1×105個/孔接種至24孔板，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書分別將control mimic、miR-15a-5p mimic、control inhibitor、miR-15a-5p inhibitor轉染至MCF-7細胞，記為miR-NC組、miR-15a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-15a-5p組；選擇轉染control inhibitor和miR-15a-5p inhibitor的細胞，在培養液中加入PCA并調整終濃度為5.0 mmol/L，常規培養48 h。

將MCF-7細胞隨機分為Con組、不同濃度PCA處理(0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、10 mmol/L)組、PCA組。處理方法：Con組不添加PCA；不同濃度PCA處理組在細胞培養基中加入PCA并調整終濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L；PCA組：以含終濃度為5.0 mmol/L PCA的培養基培養細胞。每組6個復孔，重復3次。

1.4MTT檢測細胞增殖 在各組細胞培養至24 h、48 h、72 h時加入20 μl的MTT(5 g/L)溶液；孵育4 h后，去除多余培養液，加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩反應10 min，使用酶標儀檢測490 nm波長處的各組吸光度值(OD)。每組設6個重復。

1.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲 取各組對數生長期的細胞，將其制備成1×104個/ml的單細胞懸液。細胞遷移實驗：取200 μl細胞懸液接種到Transwell小室上室中，下室加入600 μl含10 % 胎牛血清的DMEM培養基，常規培養24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，PBS洗滌，甲醇固定30 min，0.1 %結晶紫染色20 min，PBS洗滌，自然風干后隨機選6個視野觀察穿過濾膜的細胞數，取均值。細胞侵襲實驗：以1∶5比例加入DMEM培養基稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，風干成膠后，按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

1.6qRT-PCR檢測miR-15a-5p表達量 取MCF-7細胞和PCA(5.0 mmol/L)處理的MCF-7細胞，用Trizol試劑提取總RNA，按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，置于實時熒光定量儀上進行PCR擴增。每個樣品重復3次，以GAPDH為內參，通過2-△△Ct法分析結果。內參引物序列如下：GAPDH反義：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，正義：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.7Western印跡檢測蛋白表達 各組對數生長期細胞加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5 % 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入AKT3抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，電化學發光顯影，每個蛋白樣品重復3次。

1.8雙熒光素酶報告基因實驗 Targetscan在線預測發現AKT3 3′-非翻譯區(UTR)上存在miR-15a-5p的結合位點，為進一步驗證AKT3是否是miR-15a-5p的靶基因，構建野生型AKT3-3′UTR(WT)和突變型AKT3-3′UTR(MUT)的全長質粒載體，參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書分別與miR-15a-5p mimic共轉染至MCF-7細胞，37℃、5%CO2培養48 h后按照雙熒光素酶報告基因試劑盒操作步驟進行檢測，相對熒光強度=螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1PCA對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與Con組相比，隨著PCA濃度的增加，MCF-7細胞24 h、48 h、72 h的抑制率逐漸增強。選用作用時間48 h，抑制率約為50%的PCA濃度(5.0 mmol/ml)用作后續實驗。見表1。與Con組相比，PCA組MCF-7細胞的遷移和侵襲量均顯著降低(P<0.001)。見表2。

表1 不同濃度PCA對MCF-7細胞抑制率的影響

與Con組比較:1)P<0.05

表2 PCA對MCF-7細胞遷移、侵襲的影響個)

2.2PCA對miR-15a-5p表達的影響 與Con組(1.13±0.01)相比，PCA組miR-15a-5p的表達量(1.82±0.13)顯著增加(t=9.166,P<0.01)。

2.3miR-15a-5p對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-15a-5p組MCF-7細胞的增殖抑制率顯著升高，細胞的遷移和侵襲量顯著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。見表3。

表3 miR-15a-5p對MCF-7細胞遷移、侵襲、增殖的影響

2.4抑制miR-15a-5p表達逆轉了PCA對MCF-7細胞遷移、侵襲和增殖的抑制作用 與Con組相比，PCA組的MCF-7細胞增殖抑制率明顯升高，細胞遷移和侵襲量顯著降低(P<0.05)；將miR-15a-5pinhibitor轉染至MCF-7細胞并經PCA處理后，與PCA+anti-miR-NC組相比，PCA+anti-miR-15a-5p組的MCF-7細胞增殖抑制率明顯降低，細胞遷移和侵襲量顯著增加(P<0.05)。見表4。

表4 抑制miR-15a-5p表達逆轉了PCA對MCF-7細胞遷移、侵襲和增殖的抑制作用

與Con組比較:1)P<0.05；與PCA+anti-miR-NC組比較:2)P<0.05

2.5AKT3為miR-15a-5p的靶基因 Targetscan軟件預測結果顯示，miR-15a-5p與AKT3之間存在互補結合位點(圖1)。雙熒光素酶報告基因實驗結果如表5所示：與miR-NC組比較，共轉染miR-15a-5p mimic和AKT3 3′UTR-WT野生型載體的MCF-7細胞，熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；共轉染miR-15a-5p mimic和AKT3 3′UTR-MUT突變型載體的MCF-7細胞，熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。將miR-15a-5p mimic、miR-15a-5pinhibitor轉染至MCF-7細胞中，與miR-NC組(0.61±0.06)相比，miR-15a-5p組的MCF-7細胞AKT3蛋白表達量(0.22±0.03)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.51±0.05)相比，anti-miR-15a-5p組的MCF-7細胞AKT3蛋白表達量(0.93±0.09)顯著升高(P<0.05)。見圖2。

2.6抑制miR-15a-5p的表達恢復PCA對MCF-7細胞中AKT3蛋白表達的抑制作用 與Con組(1.06±0.11)相比，PCA組的MCF-7細胞中AKT3蛋白的表達量(0.47±0.03)顯著降低(P<0.05)；與PCA+anti-miR-NC組(0.42±0.03)相比，PCA+anti-miR-15a-5p組的MCF-7細胞中AKT3蛋白的表達量(0.76±0.06)顯著升高(P<0.05)。提示，抑制miR-15a-5p恢復了PCA對MCF-7細胞AKT3蛋白表達的抑制作用。見圖3。

圖1 AKT3的3′UTR中含有miR-15a-5p的互補核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組,miR-15a-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-15a-5p組圖2 各組AKT3蛋白的表達

圖3 各組AKT3蛋白的表達

3 討 論

我國2015年乳腺癌新發病例約27萬，占全國惡性腫瘤的15%，死亡7萬例〔10〕。目前手術切除仍然是乳腺癌的主要治療手段，有可能造成癌細胞種植、增生和轉移，在臨床研究中發現，麻醉藥物與腫瘤細胞直接作用可影響腫瘤生長、侵襲和轉移，對化療藥物的敏感性也有影響〔11〕。PCA是常用的局部麻醉藥物之一，在某些癌癥中被證明是一種潛在的DNA甲基化抑制劑，甲基化水平增高可使抑癌基因失活，促進腫瘤的生長〔12〕。在胃癌〔13〕、結腸癌〔14〕中，PCA顯著降低了整體DNA甲基化水平，并對癌細胞有生長抑制和凋亡誘導的作用，從而抑制癌癥的發展。PCA可將乳腺癌細胞MDA-MB-231阻滯在S期，降低細胞存活率，抑制其遷移〔15〕。本研究發現，PCA對乳腺癌細胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度、時間依賴性；PCA(5.0 mmol/L)處理的MCF-7細胞其遷移和侵襲量均明顯降低。

microRNA是在生物體內發現的一類長度為21-25nt的非編碼小分子RNA，參與細胞的生長、分化和細胞周期調控等多個環節，并且miRNA在導致細胞癌變及癌細胞增殖和轉移等各階段具有關鍵作用〔16〕。miR-15a-5p是miR-15家族的一個成員，由位于染色體13q14區域內的基因編碼，以往研究發現，miR-15a在乳腺癌細胞MCF-7中明顯低表達，miR-15a可通過靶向于抗凋亡基因B細胞淋巴瘤(Bcl)-2誘導乳腺癌細胞凋亡〔17〕。多項研究表明，miR-15a-5p在子宮內膜癌〔18〕、肺癌〔19〕、肝癌〔20〕的組織及細胞中均呈低表達，過表達miR-15a-5p可抑制癌細胞的增殖和遷移能力及癌細胞的上皮間質轉化。本研究發現，PCA處理的MCF-7細胞中miR-15a-5p的表達水平顯著上調，過表達miR-15a-5p可抑制MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲；將miR-15a-5p inhibitor轉染至MCF-7細胞并經PCA處理后，MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著提高。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，AKT家族主要包括AKT1、AKT2、AKT3三種亞型，AKT是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路下游的主要效應分子，在細胞代謝、細胞生長凋亡等多種生物學過程中發揮重要作用〔21〕。AKT作為一種原癌基因，已成為醫學界的關注熱點，在乳腺癌的研究中，AKT3過表達可增強乳腺癌細胞的增殖，增加癌細胞致瘤性〔22〕。本研究通過預測發現了AKT3是miR-15a-5p的靶基因，并運用熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-15a-5p與AKT3之間的靶向關系。PCA處理的MCF-7細胞中AKT3表達下調，抑制miR-15a-5p恢復了PCA對MCF-7細胞AKT3表達的抑制作用。

綜上，PCA能夠抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖、遷移和侵襲能力，可能是通過調控miR-15a-5p/PI3K-AKT3途徑的表達來實現的。