miR-130b通過調控p53抑制局灶性腦缺血大鼠神經細胞凋亡

鄒瑜 鐘純正 郭春宣 王御林

(儋州市人民醫院神經內科，海南 儋州 571700)

缺血性腦卒中發生率約占腦卒中發生率的80%，缺血性腦卒中的發生是由于各種原因引起的腦供血不足和氧氣缺乏，導致腦組織壞死〔1～3〕。局灶性腦缺血后再灌注有時不僅能恢復正常腦功能，還會加重組織損傷和功能障礙，這稱為腦缺血再灌注損傷。由于人體的補償，再灌注引起的損傷只發生在一側，即局灶性血液再灌注損傷〔4，5〕。凋亡與神經細胞死亡密切相關，并導致神經功能缺損。miRNAs是一類小的(19～24個核苷酸)非編碼RNA，其通過介導翻譯轉錄后抑制或促進RNA來靶向表達，它們在各種生物學和病理學過程，如細胞增殖、分化、凋亡和致癌作用中起重要調節作用〔6，7〕。至少20%～30%的人蛋白質編碼基因的表達受miRNA的調節。在哺乳動物中樞神經系統(腦和脊髓)中發現了許多miRNA，它們在神經發育中起關鍵作用。 局灶性腦缺血改變miRNA表達參與許多繼發性損傷反應，包括氧化應激，炎癥和神經異常細胞凋亡。miR-130b通過抑制慢性坐骨神經壓迫損傷(CCI)大鼠背根神經節(DRG)中Nav1.3抗體的表達抑制神經元細胞的凋亡〔8〕。此外，miR-130b通過調節抗凋亡基因Bcl-2的表達顯示出神經保護作用。p53是常規的凋亡蛋白，可通過調控人內皮抑素基因(Cipt)表達而調控細胞生長，p53蛋白可刺激Cipt基因產生分子量為21 kD的蛋白，這種蛋白能夠有效抑制某些促使細胞通過細胞周期進入有絲分裂的酶活性，從而促進細胞凋亡〔9，10〕。本研究擬探討miR-130b、p53與局灶性腦缺血大鼠神經細胞凋亡的關系，為局灶性腦缺血的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1動物分組 SD大鼠60只，6～8周齡，體重250～300 g，山東大學醫學院動物實驗中心提供〔許可證號：SCXK(魯) 20001003〕；本研究方案經本院動物研究委員會批準，符合美國國立衛生研究院動物使用和護理指南。動物隨意獲取食物和水，自動控制晝夜循環(12/12 h)，室溫(22±1)℃，將大鼠飼養在12小時光-暗循環下，并允許在手術前后自由獲取食物和水。大鼠根據體重隨機分成3組：局灶性腦缺血組、miR-130b模擬物(mimics)組、miR-130b抑制劑組，每組20只，雌雄各半。

1.2立體定向轉基因入腦 miR-130b抑制劑、miR-130b抑制劑質粒由上海生工科技有限公司合成，濃度分別為100 ng/μl、99 ng/μl，-20℃冰箱保存備用。將大鼠常規麻醉俯臥位固定于立體定向儀。頭皮常毒、備皮，無菌操作，暴露顱骨表面、前囟、矢狀縫，牙鉆于距矢狀縫右側3.8 mm、前囟前1.7 mm處轉孔，隨后，微量加樣器注入5 μl miR-130b mimics，注射結束5 min后撤出微量加樣器，以骨蠟封閉顱骨孔道；相同方法于正中線右側3.8 mm、前囟后3.3 mm、深2.3 mm處5 μl miR-130b mimics。局灶性腦缺血組、miR-130b抑制劑組分別用同樣方法注入等量生理鹽水或質粒miR-130b抑制劑，其他操作步驟同前。

1.3局灶性腦缺血大鼠模型的制備 通過大腦中動脈(MCA)的短暫閉塞誘導局灶性腦缺血。通過腹膜內注射30 mg/kg唑來樣和10 mg/kg甲苯噻嗪的混合物誘導麻醉。將大鼠置于加熱墊上的仰臥位置，根據直腸溫度計將其體溫保持在37℃±0.5℃。在手術顯微鏡下，通過中線切口暴露右側頸總動脈，頸外動脈(EC)和頸內動脈(IC)。將EC結扎，凝固，并在舌和上頜動脈分支近端切斷。 EC的所有其他分支被凝固并橫切。然后將IC從迷走神經中分離以防止損傷。通過小切口將具有火焰圓頭的4-0單絲尼龍縫合線插入IC、EC殘端。從頸總動脈的分叉到縫合線尖端的距離大約為18.5 mm，這與大腦中動脈閉塞(MCAO)模型的公開描述一致。通過使用激光多普勒血流計監測腦血流，其中柔性探針放置在由MCA提供的皮質區域中(后部2 mm和前囟側部6 mm)。當通過線程封閉MCA時，未顯示出至少70%的腦血流減少的大鼠被排除在實驗之外。閉塞60 min后，取出縫合線縫合皮膚，讓大鼠恢復。

1.4腦梗死灶內緣距上矢狀線距離、腦梗死體積 試驗結束后(24 h后)，頸椎脫臼處死大鼠，獲取腦組織，立刻用游標卡尺測量上述兩注射點中點三處冠狀軸與腦梗死內緣的距離，并用顯微圖像分析系統分析腦梗死體積，隨后將腦組織置于液氮中保存。

1.5大鼠局灶性腦缺血組織神經細胞凋亡檢測 腦組織進行常規染色切片，末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶) 介導的帶熒光的三磷酸脫氧尿甘(dUTP)缺口末端標記法(TUNEL)檢測大鼠神經細胞凋亡情況。

1.6各組大鼠局灶性腦缺血組織神經細胞凋亡率及G1期的測定 將腦組織制成神經單細胞懸液，流式細胞術膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)結合測定(R&D，Minneapolis，MN，USA，Cat No TA4638)用于測定各組神經細胞的細胞凋亡和細胞周期。 用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸分離細胞，并以1 000 r/min，離心5 min。 然后，洗滌細胞沉淀并重懸于微量離心管中的結合緩沖液中。 將5 μl FITC-綴合的AnnexinV和10 μl碘化丙啶(PI)加入管中，混合并在黑暗中溫育10 min。 使用FACS Calibur系統測試標記的細胞，并測定凋亡百分比及細胞周期。

1.7各組大鼠局灶性腦缺血組織miR-130b、p53 mRNA表達水平的測定 使用mirVana RNA分離試劑盒(Ambion，CA)分離總RNA。 將微量腦組織在變性緩沖液中裂解，然后使用酸性酚：三氯甲烷提取RNA以除去大部分DNA。 進行定量實時PCR以量化各種處理期間特定總RNA的水平。 使用SYBR-green Rox mix在Master cycler梯度(Applied Biosystems 7500序列檢測系統)中進行定量實時PCR。miR-130b引物序列為5′-TTTGCTTCAGGGTTTCA-TCC-3′(正向)和5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′(反向)；p53的引物序列為5′-CCCACTCACCGTACTAA-3′(正向)和5′-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3′(反向)；GAPDH(內標)是5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCT-3′(正向)和5′-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3′(反向)。

1.8各組大鼠局灶性腦缺血組織含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase6、caspase9蛋白表達水平的測定 按照無菌條件操作，稱取0.1 g心肌組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將腦碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入2 ml EP管中，加入1.2 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)，充分振蕩混勻，5 000 r/min，4℃，離心20 min。仔細收集上清液。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)用于測定組織液中caspase3、caspase6、caspase9的水平。

1.9統計學方法 采用SPSS23.0進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1各組大鼠局灶性腦缺血組織腦梗死灶內緣距上矢狀線距離比較 miR-130b mimics組腦梗死灶內緣距上矢狀線距離顯著高于局灶性腦缺血組〔(4.68±0.38)mm vs (2.59±0.32)mm;P<0.05〕，miR-130b抑制劑組〔(1.78±0.65)mm〕腦梗死灶內緣距上矢狀線距離顯著低于局灶性腦缺血組和miR-130b mimics組(P<0.05)。

2.2各組局灶性腦缺血組織腦梗死體積比較 miR-130b mimics組腦梗死體積顯著低于局灶性腦缺血組〔(258±62)mm3vs (339±73)mm3;P<0.01〕，miR-130b抑制劑組〔(401±65)mm3〕腦梗死體積顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)。

2.3各組大鼠局灶性腦缺血組織TUNEL 陽性細胞數比較 miR-130b mimics組TUNEL 陽性細胞數顯著低于局灶性腦缺血組〔(24.84±2.87)個 vs (39.70±2.54)個；P<0.05〕，miR-130b抑制劑組〔(47.94±2.12)個〕TUNEL 陽性細胞數顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics 組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠局灶性腦缺血組織TUNEL 陽性細胞數比較(×200)

2.4各組局灶性腦缺血組織神經細胞凋亡率的比較 miR-130b mimics組神經細胞凋亡率顯著低于局灶性腦缺血組(P<0.05)，miR-130b抑制劑組細胞凋亡率顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130bmimics組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.5各組局灶性腦缺血組織神經細胞凋G1期比較 miR-130b mimics組G1期顯著高于局灶性腦缺血組(P<0.01)，miR-130b抑制劑組G1期顯著低于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics 組(P<0.05)。見表1。

2.6各組局灶性腦缺血組織miR-130b、p53 mRNA表達水平比較 miR-130b mimics組miR-130b mRNA表達水平顯著高于局灶性腦缺血組(P<0.05)，p53 mRNA表達水平顯著低于局灶性腦缺血組(P<0.05)；miR-130b抑制劑組miR-130b mRNA表達水平顯著低于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)，p53 mRNA表達水平顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)。見表1。

2.7各組局灶性腦缺血組織caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達水平比較 miR-130b mimics組caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達水平顯著低于局灶性腦缺血組(P<0.05)，miR-130b抑制劑組caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達水平顯著高于局灶性腦缺血組及miR-130b mimics組(P<0.05)。見表1。

2.8各變量的相關性分析 miRNA-130b與p53、caspase3、caspase6、caspase9呈顯著負相關(r=-0.569、-0.644、-0.543、-0.476，均P<0.001)。

表1 各組細胞凋亡率、G1期、miR-130b mRNA、p53 mRNA及caspase3、caspase6、caspase9蛋白表達水平比較

與局灶性腦缺血組相比:1)P<0.05；與miR-130b mimics組相比:2)P<0.05

3 討 論

miR-130b在大腦的各個區域表達，尤其是在神經元及一些內分泌細胞類型和視網膜桿細胞中表達特別高，與線粒體功能密切相關。miR-130b在生理學上有非常重要的作用〔11〕。miR-130b可保護神經細胞免受腦卒中損傷，淀粉樣蛋白毒性和缺氧損傷。遺傳連鎖分析發現腦神經元中miR-130b表達水平低，阿爾茨海默病風險增加。經歷缺氧再灌注攻擊的神經細胞的miR-130b能保護與維持線粒體功能、三磷酸腺苷(ATP)濃度及鈣穩態。miR-130b實現這種神經保護活性的確切機制仍存在爭議。研究表明，miR-130b可促進神經紅蛋白的高水平表達，神經紅蛋白可以提供儲備氧儲存，結合氧的神經紅蛋白經歷快速自動氧化并且對氧具有相對低的結合親和力，因此，神經紅蛋白似乎具有與氧氣儲存和運輸分開的生理功能，神經紅蛋白還能清除氧化應激產物一氧化氮〔12，13〕。研究表明〔14〕，miR-130b能抑制Rac1介導的肌動蛋白裝配和膜微區的聚集，其參與死亡信號轉導途徑的調節。體外細胞試驗〔15〕表明，miR-130b可截斷線粒體凋亡途徑源于觀察到miR-130b迅速降低神經細胞色素水平。miR-130b對原代神經元及神經元細胞及受到低氧攻擊的動物的保護作用與其抗線粒體凋亡途徑密切相關〔16〕。

本研究結果說明miR-130b能明顯降低大鼠局灶性腦缺血損傷程度，miR-130b能明顯降低大鼠局灶性腦缺血神經細胞凋亡程度。

細胞學試驗表明，miR-130b抑制細胞凋亡與靶向p53的調控密切相關。腫瘤抑制因子p53起轉錄因子的作用，p53、p63、p73組成的細胞因子網絡為發育過程與腫瘤發生之間緊密聯系的證據〔17〕。p63可以響應應激信號誘導細胞生長停滯和凋亡，這兩種功能特性與p53共有。據報道，腫瘤抑制因子p53、p63和p73作為miRNA加工組分的正調節劑和負調節劑起作用〔18〕。p53、p63和p73調節miRNA的加工，如let-7、miR-200c、miR-143、miR-107、miR-16、miR-145、miR-134、miR-449a、miR-503和miR-21。另一方面，p53受多種機制調節，包括轉錄mRNA及蛋白質穩定性。miR-130b miRNA參與p53調控〔17〕。此外miR-130b靶向調控p53抑制癌細胞的凋亡與G1-S相變的加速，p21Cip1和p27Kip1的下調及細胞周期蛋白D1的上調有關。p53的過表達是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號轉導及細胞周期進展至G1期的必要條件。此外，PI3K/AKT的激活增加p21Cip1和p27Kip1的細胞水平，并抑制細胞周期蛋白D1的表達，從而抑制細胞凋亡〔19〕。本研究結果說明miR-130b能抑制p53的表達進而抑制局灶性腦缺血大鼠神經細胞凋亡；同時也說明其抑制凋亡機制可能與抑制caspase3、caspase6、caspase9的表達有關。

綜上所述，miR-130b能明顯降低大鼠局灶性腦缺血損傷程度，降低神經細胞凋亡程度；其機制與miR-130b能抑制p53的表達進而抑制局灶性腦缺血大鼠神經細胞凋亡，抑制caspase3、caspase6、caspase9的表達有關。