小腸出血損傷對大鼠腸黏膜內跨細胞白蛋白轉運的影響

李雪蓮 王嵐 楊杰 陳曉琴 劉琦

(貴州醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 貴陽 550004)

胃腸功能紊亂可導致營養吸收障礙，降低機體防御功能〔1,2〕。當腸黏膜發生破壞時，會使機體發生炎癥反應及多器官功能失常等〔3〕。臨床上，非甾體類抗炎藥(NSAIDs)是常用的抗炎藥物之一，被廣泛用于關節炎、傷寒類、炎癥、腰痛和膠原類等疾病的治療〔4〕。其通過抑制花生四烯酸代謝過程中的環氧化酶來發揮藥效，包括抗炎、鎮痛及解熱等藥效〔5〕。但NSAIDs能夠誘發胃腸道損傷、溶血、穿孔及腎損害等〔6,7〕。盡管NSAIDs具有十分重要的臨床價值，但其不良反應，尤其是對小腸黏膜出血及損傷作用需要被重視〔8〕。白蛋白的跨細胞轉運是機體重要的生理功能。首先，可以維持內皮屏障的完整性，使內膜屏障得到增強〔9〕。其次，其具有協同轉運的作用，白蛋白會與機體內的多種物質結合，包括與藥物的結合，協助物質跨細胞轉運〔10〕。白蛋白的跨細胞轉運與機體的防御功能有密切關系〔11〕。研究證實，白蛋白與轉化生長因子的氨基酸序列十分相似，因此具有重要的生理意義〔12〕。本研究探討小腸出血損傷對大鼠腸黏膜內跨細胞白蛋白轉運的影響，從而為研究NSAIDs腸黏膜損傷的發生機制及其對腸黏膜中白蛋白跨細胞轉運的影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 40只SD雄性大鼠，體重240～280 g，購自北京維通利華公司。雙氯芬酸(商品名：戴芬)購自德國克林格公司；一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白購自北京索萊寶生物技術公司；異硫氰酸熒光素購自上海朝暉制藥廠。

1.2實驗分組及給藥 采用隨機法分為對照組和模型組，每組20只。每組再隨機分為急性期(T1)亞組和亞急性期(T2)亞組，每組10只。對照組以1 ml純化水灌胃；模型組以7.5 mg/kg雙氯芬酸灌胃建立腸黏膜損傷模型。T1亞組灌胃1 d斷頸處死；T2亞組灌胃5 d斷頸處死。大鼠禁食，不禁水24 h，用1%戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉后斷頸處死，肉眼觀測全小腸黏膜損傷情況并評分。實驗結束取下腔靜脈血10 ml，2 000 r/min離心10 min后取上清液，-20℃保存，用于后續血液指標的測定；用肝素化生理鹽水30 ml(25 kU/L)經腸系膜上動脈沖洗小腸血管，收集小腸黏膜標本用于后續檢測。

1.3小腸損傷程度大體評分 依據Reuter評分法對大鼠小腸損傷程度進行大體評分。主要分為潰瘍和粘連兩種評價標準。粘連：0分為無粘連；1分為粘連較輕；2分為粘連較重。潰瘍評分標準：0分為未出現潰瘍；1分為小腸局部充血，然而未見潰瘍；2分為小腸潰瘍不伴充血或腸壁增厚；3分為一個部位出現潰瘍與炎癥；4分為兩個或更多部位有潰瘍或炎癥；5分為存在小腸穿孔。潰瘍評分和粘連評分之和為總分值。

1.4小腸損傷的病理評分 利用Chiu氏評分法對小腸損傷程度進行病理評分。分為5個等級，即0～5分。5分為小腸絨毛脫落，出血和潰瘍形成；4分為小腸上皮細胞脫落壞死，部分絨毛脫落，毛細血管充血或擴張；3分為小腸固有層有水腫，小腸黏膜上皮細胞發生壞死，少數小腸絨毛頂端發生脫落；2分表示小腸中度固有層水腫，小腸上皮間隙擴大，中央乳糜管擴張；1分表示小腸毛細血管充血，并伴有絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙；0分表示小腸黏膜絨毛正常。樣本在光學顯微鏡下觀察，每個樣本取20個視野。

1.5檢測血清NO含量 利用硝酸還原酶法測定NO含量。嚴格按照試劑盒說明書進行。NO含量(μmol/L)=(測定管的吸光度-空白管的吸光度)/(標準管的吸光度-空白管的吸光度)×標準品的濃度(100 μmol/L)×樣本測試前的稀釋倍數。

1.6血清白蛋白水平檢測 實驗結束后，取下腔靜脈血10 ml，2 000 r/min離心10 min后取上清液。采用溴酚綠法測定。

1.7測定大鼠小腸血管壁的通透性 取500 mg大鼠小腸空腸組織，加入生理鹽水(5 ml/g組織)后勻漿，3 500 r/min離心10 min后取上清液，加入等量飽和硫酸銨混勻，4℃放置12 h，3 500 r/min離心15 min后取上清液測熒光值，據此推算小腸組織熒光白蛋白含量，以此反映小腸血管壁的通透性。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0統計軟件行LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1實驗動物存活情況 對照組中的T1和T2亞組大鼠全部存活；模型組中的T1亞組全部存活，T2亞組在第5天死亡3只。死亡原因為腸道穿孔和腹腔感染。

2.2小腸損傷程度大體評分 模型組小腸大體損傷指數評分明顯高于對照組(T1、T2亞組均為0.0分)(P<0.05)；與T1模型組(3.0分)相比，T2模型組(5.5分)小腸的損傷情況明顯加重(P<0.05)，見圖1。

2.3小腸損傷程度病理評分 模型組(T1、T2亞組分別為2.5分、5.0分)小腸黏膜損傷病理指數評分顯著高于比對照組(T1、T2亞組均為0.0分，P<0.05)；T1模型組小腸黏膜見潰瘍、糜爛、紅斑，局部見腸腔囊樣擴張；T2模型組3只大鼠小腸黏膜存在竇道形成、腸穿孔、腸腔狹窄和潰瘍。T2模型組小腸黏膜的損傷情況比T1模型組更嚴重(P<0.05)。

圖1 各組小腸損傷程度光學顯微鏡下觀察

2.4各組血清NO和白蛋白含量比較 T1模型組血清NO含量顯著低于T1對照組(P<0.05)；T2模型組顯著高于T1對照組和T1模型組(P<0.05)。T1、T2模型組血清白蛋白含量顯著低于T1、T2對照組(P<0.05)，與T1模型組相比，T2模型組顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組血清NO、白蛋白含量比較

與T1對照組比較:1)P<0.05；與T1模型組比較:2)P<0.05；與T2對照組比較：3)P<0.05

2.5各組小腸血管壁通透性比較 與T1、T2對照組〔熒光標記白蛋白(0.853±0.091)、(0.826±0.094)μmol/g〕相比，T1、T2模型組通透性〔(1.213±0.114)、(1.563±0.207)μmol/g〕明顯增加(P<0.05)，與T1模型組相比，T2模型組顯著升高(P<0.05)。

3 討 論

NSAIDs可誘發腸黏膜損傷，其導致的腸道損傷包括黏膜炎癥、吸收障礙、黏膜潰瘍、腹瀉、出血穿孔及腸腔狹窄等〔13〕。腸道黏膜屏障由生物屏障、機械屏障、免疫屏障和化學屏障構成。相互連接緊密的腸黏膜上皮構成腸道黏膜的機械屏障。由腸黏膜上皮細胞分泌的腸腔內正常菌群及消化液、黏液組成。腸道內的分泌型抗體及分布在腸黏膜淋巴組織構成腸道黏膜屏障的免疫屏障。腸內正常菌群對外來菌株的抵抗作用構成了腸道黏膜屏障的生物屏障。本研究結果證實，雙氯芬酸會導致小腸黏膜損傷，且隨著時間延長，會加重小腸黏膜的損傷程度。由于雙氯芬酸是腸溶性藥物，主要在腸道被吸收，因此會造成明顯的腸道損傷，腸黏膜可見細胞脫落和糜爛，且進一步檢測可發現由氧化應激引起的內質網擴張、空腸細胞自噬形成、絨毛減少及線粒體損傷。

NO可以修復胃腸黏膜潰瘍，從而保護胃腸道。同時，NO對NSAIDs導致的腸黏膜潰瘍也具有保護作用，主要通過抑制腸道運動過強、阻止細菌轉移、增加黏液的分泌量來完成。NSAIDs會導致結構性NO合酶活性降低，從而減少NO的生成量，使細胞發生凋亡，延遲了修復的過程〔14〕。研究發現，NO產量過高時，會引起細胞的毒性作用，可以抑制細胞內線粒體的呼吸作用，該過程造成黏膜細胞氧化損傷，最終損傷腸道黏膜〔15〕。本實驗結果表明NO參與雙氯芬酸誘發的小腸黏膜損傷過程。本研究還發現，在小腸黏膜損傷后，大鼠血清白蛋白的含量也出現下降趨勢，血清白蛋白下降的主要原因可能是由于毛細血管通透性的增加，而后期則可能是由于血容量增加和白蛋白合成速率降低的共同作用。同時，在對大鼠注射熒光標記白蛋白后，發現雙氯芬酸導致小腸出血損傷后，會使小腸血管壁的通透性增加。

綜上所述，雙氯芬酸能夠誘發急性或亞急性的腸黏膜損傷，導致小腸黏膜出血、糜爛甚至潰瘍。并證實NO可能參與腸黏膜的損傷過程，同時小腸出血會導致血清中白蛋白含量降低，使小腸血管壁的通透性增加。