CD3+CD56+CD16+ NKT細胞、T淋巴細胞亞群在URSA患者外周血表達的意義1

陳建安，陳麗莉，丁 茜，周 靜，何永明，吳伯艷，朱學海

(中山大學附屬東華醫院檢驗科，廣東東莞 523110)

不明原因反復自然流產(URSA)指除解剖因素、遺傳疾病、內分泌疾病及感染等因素致胎兒非正常發展，連續2次或多次懷孕時，在同一妊娠周期發生自然流產的現象，仍有60%～70%反復性流產患者由不明病因所致，對女性的生殖和心理健康有嚴重的傷害。目前的研究多認為，與母胎界面免疫調節失調導致URSA患者的免疫耐受失衡有關[1]，正常妊娠時，Th1/Th2平衡起著非常重要的作用，而Th1/Th2失衡時對流產的發生也有重要作用[2]。Th1/Th2平衡可影響細胞免疫與體液免疫的平衡，免疫調節細胞亦可影響Th1/Th2平衡。NKT細胞是一種免疫調節性淋巴細胞，而淋巴細胞亞群分析能很好地反映細胞和體液免疫功能，本研究旨在研究URSA患者外周血CD3+CD56+CD16+NKT細胞和T淋巴細胞亞群的表達情況，為了解URSA患者的細胞免疫功能狀態提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年11月至2018年10月來中山大學附屬東華醫院婦科門診或生殖中心就診的URSA患者53例為研究對象，年齡21～43歲，具有3次或3次以上自然流產史，排除解剖因素、遺傳疾病、內分泌疾病及感染等因素的女性患者。健康對照組22例為體檢健康婦女，年齡18～36歲。分別抽取URSA患者和健康對照組婦女靜脈全血2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內,混勻后送檢，常溫保存，48 h內上機檢測。

1.2儀器與試劑 儀器為美國Beckman-coulter公司生產的FC500MCL流式細胞儀，試劑為廣東國藥有限公司提供的Beckman-coulter公司生產的CD45-異硫氰酸熒光素(FITC))/CD8-藻紅蛋白(PE)/CD4-藻紅蛋白-德克薩斯紅(ECD)/CD3-藻紅蛋白-花青素(PC5)；CD45-FITC/CD56+16-PE/CD19-ECD/CD3-PC5等熒光抗體試劑，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，紅細胞裂解液。

1.3檢測方法 分別加入CD45-FITC/CD8-PE/CD4-ECD/CD3-PC5，CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5試劑各5 μL至2管流式專用管內底端，同時分別加入50 μL抗凝全血避光反應20 min，加入紅細胞裂解液 500 μL，避光 20 min 后加入 PBS 上機檢測，用CD45/SS設門圈定淋巴細胞群。在十字門圖中分別分析CD3+區域細胞百分比，即為CD3+T細胞；CD3+且CD4+區域細胞的百分比，即為CD3+CD4+Th細胞表達率；在CD3+而CD8+性區域的百分比，即為CD3+CD8+Tc細胞表達率；在CD3-而CD19+性區域的百分比，即為B細胞表達率; 在CD3-而CD56+CD16+性區域的百分比，即為NK細胞表達率; 在CD3+而CD16+56+性區域的百分比，即為NKT細胞表達率。

2 結 果

2.1CD3-CD56+CD16+NK細胞、CD3+CD56+CD16+NKT細胞在URSA患者外周血的表達情況 CD3+CD56+CD16+NKT細胞在URSA患者組外周血表達率明顯高于健康對照組(t=2.924,P<0.01)，而 CD3-CD56+CD16+NK細胞和B淋巴細胞在URSA患者外周血表達與健康對照組比較，差異無統計學意義(t=0.773、-0.162，均P>0.05)。見表1。

表1 CD3-CD56+CD16+ NK細胞、CD3+CD56+CD16+ NKT細胞在URSA患者和健康對照組外周血的表達率比較

2.2T淋巴細胞亞群在URSA患者外周血的表達情況 CD3+T細胞、CD3+CD4+Th細胞、CD3+CD8+Tc細胞在URSA患者外周血表達率與健康對照組比較,差異無統計學意義(t=0.591、0.007、0.354,均P>0.05)，Th/Tc比值在URSA患者較健康對照組偏高，差異有統計學意義(t=2.045,P<0.05)。見表2。

表2 CD3+ T細胞、CD3+CD4+ Th細胞、CD3+CD8+ Tc細胞等在URSA患者和健康對照組外周血的表達率比較

圖1 NKT細胞與Th/Tc的直線回歸關系散點圖

圖2 NKT細胞與B細胞直線回歸關系散點圖

2.3URSA患者CD3+CD56+CD16+NKT細胞與Th/Tc、B細胞的關系 CD3+CD56+CD16+NKT細胞與Th/Tc比值的相關系數為0.004 8，CD3+CD56+CD16+NKT細胞與B細胞相關系數為0.000 4，均無正相關關系(P>0.05)。見圖1、2。

3 討 論

CD3+CD56+CD16+NKT細胞是一種新鑒定的免疫調節性細胞，是一種特殊類型的T淋巴細胞，其細胞表面不僅有T細胞受體，也有NK細胞的受體[3]；NKT 細胞的表面標志物表達為CD3+CD56+CD16+，其生物學作用主要包括免疫調節和細胞毒作用。有研究認為NKT細胞被激活后分泌大量的細胞因子，包括白細胞介素(IL)-4、IL-10、IL-13，及干擾素等，通過影響Th1/Th2 平衡，從而發揮免疫調節的作用[4]。

有研究認為NKT細胞與母胎界面有非常密切的關系,DANG等[5]研究顯示孕鼠的子宮中在圍著床期檢測到大量的NKT細胞，并且推測NKT細胞可能分泌IL-4，誘導Th2型微環境偏移，從而在圍著床期發揮重要的作用；且NKT細胞在誘導流產過程中可能有重要的作用。ITO等[6]研究顯示，Va14 NKT/VB7細胞與生殖免疫有一定的相關性，提出a-GaIcer以Va14 NKT細胞依賴方式引起小鼠流產。袁靜等[7]研究顯示，少量的CD3+CD56+CD16+NKT樣細胞對維持妊娠有一定的作用，其可分泌大量的細胞因子，參與機體的免疫反應，其數量的增多與妊娠結局呈負相關，當外周血中CD3+CD56+CD16+NKT細胞表達率增高時，發生流產的概率隨之升高[8]。本研究顯示，CD3+CD56+CD16+NKT細胞在URSA患者外周血表達率明顯高于健康對照組，與袁靜等[7]、蔣楠等[9]的報道相類似，提示外周血NKT細胞的增多對反復自然流產有一定的作用，可能影響Th1/Th2平衡，其偏移向Th1型時，增強細胞免疫功能，在母胎界面的免疫排斥反應亦增強，抑制免疫耐受而導致流產的發生；但與陳衛光等[10]、LIN等[11]的報道的不同，其NKT細胞較健康對照組偏低。已有報道證實，當Th1型細胞因子分泌時，活化蛻膜上的NK細胞[12]，NK細胞是一種具有細胞毒性的殺傷細胞，可激活下游一系列細胞和因子的級聯反應，放大免疫殺傷作用，因子的平衡對妊娠是否成功起重要作用[13]。

T淋巴細胞亞群主要包括輔助性T淋巴細胞(Th細胞，表型表現為CD3+CD4+)、殺傷性T淋巴細胞(Tc細胞，表型表現為CD3+CD8+Tc)，其是重要的免疫功能狀態的檢測指標，當Th/Tc升高時，提示細胞免疫功能亢進，下降提示細胞免疫功能下降。本研究顯示CD3+T細胞、CD3+CD4+Th細胞、CD3+CD8+Tc細胞在URSA患者外周血表達率與健康對照組比較，差異均無統計學意義，與司斯[14]的報道有所不同，而Th/Tc比值在URSA患者偏高，提示其細胞免疫功能亢進，可能與反復自然流產的發生有一定關系[15]。本研究顯示URSA患者外周血CD3+CD56+CD16+NKT細胞表達率與Th/Tc比值、B細胞表達率均無正相關關系，提示造成URSA患者細胞免疫功能增強而引起流產，CD3+CD56+CD16+NKT細胞與Th/Tc表達的增高無必然關系，其可能均是一種反映URSA患者細胞免疫功能狀態的獨立指標因素,因此，同時檢測此兩項指標更能提示URSA患者細胞免疫功能狀態。

綜上所述，CD3+CD56+CD16+NKT細胞、Th/Tc比值在URSA患者外周血表達水平與反復自然流產的發生有一定的關系，通過檢測CD3+CD56+CD16+NKT細胞和Th/Tc比值對評估USRA患者的免疫功能狀態和臨床對患者免疫功能的有效干預有重要意義。