移植患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞、TGF-β1 及IL-10的表達

周文超，黃生耀，李 薇，熊小敏，蔡祥勝，郭 煜，馮紅梅，徐曉松，陳思聰

(1.沈陽急救中心 急診科，遼寧沈陽 110000；2.廣州軍區廣州總醫院/廣州軍區檢驗中心，廣東廣州510010；3.東莞仁康醫院檢驗科，廣東東莞 523952；4.廣東藥科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州 5 10080)

目前，大量的動物實驗及臨床研究均表明,調節性T細胞(Treg細胞)在移植免疫耐受的形成密切相關，一部分器官移植的受者逐漸對移植器官產生免疫耐受，將這部分受者血液中的CD4+T細胞被動地轉移給其他宿主，也能獲得同樣的免疫耐受效果，此即“主動移植耐受”。Treg細胞發揮免疫抑制功能與一些細胞因子，如白細胞介素(IL)-2、IL-10、轉化生長因子β(TGF-β)等[1]。本研究通過分析肝腎移植患者前后外周血中Treg細胞的百分比的變化及細胞因子的表達，進一步了解Treg和細胞因子與移植免疫耐受的相關性，為臨床移植免疫耐受研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年5-12月廣州軍區廣州總醫院肝膽外科及泌尿外科肝腎移植患者15例為移植組。其中腎移植7例，肝移植8例；男12例，女3例；年齡23～64歲，平均46歲。

1.2試劑 試劑為CD4-FITC、CD25-PE、Mouse Anti-Hunan CD127-PerCP-CyTM5.5、MouseIgG1-PE、MouseIgG1-PerCP-Cy5.5、溶血劑、鞘液，均購自美國BD Biosciences公司。TGF-β1、IL-10試劑盒均購自德國IBL(IBL International GmbH)公司。

1.3實驗方法 清晨空腹采取靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-K3)抗凝，每份標本設測定、同型對照2管，分別于2管中各加入100 μL抗凝血后，于測定管中加入CD4-FITC 10 μL、CD25-PE 10 μL、PerCP-CyTM 5.5 Mouse Anti-Hunan CD127 2 μL，同型對照加入CD4-FITC、MouseIgG1-PE各10 μL，MouseIgG1 percp-Cy5.5 2 μL，振蕩混勻，室溫避光標記15 min；加入1 mL溶血劑，振蕩混勻，室溫避光溶血10 min；2 000 r/min離心2 min棄上清液，加鞘液1 mL，2 000 r/min離心2 min，棄上清液，加入鞘液500 μL充分混勻后上機分析。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測患者外周血血清中TGF-β1、IL-10的水平，操作按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1器官移植患者移植前與對照組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的比較 器官移植患者為15例，其中腎功能不全，尿毒癥期腎移植為7例；肝癌肝硬化8例。移植組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比為(5.60±2.11)%，對照組為(3.80±1.15)%，差異有統計學意義(P=0.003)；移植組高于對照組，存在顯著性差異。見圖1。

注：移植前與對照組比較，*P<0.05。

圖1移植組移植前與對照組外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的比較

2.2移植前與移植后CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的比較 移植組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比為(5.60±2.11)%，移植后變為0，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞移植前后存在顯著性差異，其差值的均數為5.60，標準差為2.11。見圖2。

注：A、B均為移植前Treg細胞的百分比；C為移植后Treg細胞的百分比。

圖2移植前與移植后CD4+CD25+CD127lowTreg細胞

2.3器官移植前CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的百分比與TGF-β1、IL-10水平的相關性 移植前患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的百分比為(5.60±2.12)%，TGF-β1水平為(728.32±356.26)ng/L，IL-10水平為(481.85±124.04)ng/L。TGF-β1和IL-10的水平與CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比均呈正相關(r=0.627，P=0.012；r=0.544，P=0.036)。見圖3。

注：A表示與TGF-β1的相關性；B表示與IL-10的相關性。

圖3移植前Treg細胞的百分比與TGF-β1、IL-10水平的相關性

2.4器官移植前后TGF-β1、IL-10水平的比較 器官移植前TGF-β1水平為(728.32±356.26)ng/L，移植后TGF-β1水平為(685.46±281.06)ng/L，移植前高于移植后，經統計分析，差異無統計學意義(P=0.308)。器官移植前IL-10水平為(481.85±124.04)ng/L，移植后水平為(458.51±95.89)ng/L，移植前高于移植后，經統計分析，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：同一指標移植前后的比較，*P>0.05。

圖4器官移植前后TGF-β1、IL-10細胞因子水平的比較

3 討 論

肝腎移植是治療肝腎疾病終末期的有效治療方法，能延長人的生命。Treg及相關細胞因子可能與移植免疫耐受密切相關，研究移植后急性排斥反應的早期診斷，如何降低術后排斥反應的發生，誘導免疫耐受的形成仍然是當前乃致今后一段時間在此領域的研究熱點。

相關的研究數據表明，肝移植術后，占比進行肝臟移植術總人數的25%～33%患者完全接受肝臟移植物，這與其受體內Treg細胞的異常表達有關[2]。誘導型Treg主要通過分泌細胞因子IL-10及TGF-β等發揮免疫抑制作用，IL-10 及TGF-β細胞因子在一定程度上也可誘導Treg 的分化，兩者相互作用[3-4]。

羅文峰等[5]研究報道顯示,腎移植術前第1～2天，急性排斥組和穩定組的Treg細胞水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。術后4周內2組Treg細胞水平均急劇下降。術后第4～8周，穩定組受者的Treg細胞水平開始回升，而急性排斥組繼續下降。術后第8～12周，穩定組的Treg細胞水平明顯回升，但排斥組則仍維持在較低水平，且此階段2組Treg細胞水平的差異有統計學意義(P<0.05)。

有研究發現，發生急性排斥反應的肝移植體患者體內CD4+CD25+Treg細胞的量顯著低于未發生排斥的患者，這表明提高受體循環中CD4+CD25+Treg細胞的量可能有利于肝移植的存活。鐘嘉明[5]的研究報道顯示，肝移植術后，外周血CD4+CD25+Treg細胞百分比暫時下降，1年內逐漸恢復，其下降的原因可能與應用大量免疫抑制劑及激素有關。肝移植病人肝功能長期穩定時，外周血中的Treg細胞百分比與他克莫司血藥濃度有關，高血藥水平受者Treg細胞百分比顯著降低，低血藥水平受者Treg細胞水平雖有降低，但差異無統計學意義[6]。

本研究結果顯示，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞移植組顯著高于對照組。肝移植患者中，都是肝癌患者，既往的研究中肝癌組高于健康人群。移植患者移植后1、2、3周后CD4+CD25+CD127lowTreg細胞下降為0，與上述的報道存在差異[7]。Treg下降為0，可能原因為：(1)移植術后，Treg細胞重新分布于移植物、外周血和淋巴組織中，引起外周血中Treg細胞水平降低；(2)急性排斥反應時，大量的炎癥趨化因子使Treg細胞向移植物遷移，外周血中Treg細胞水平進一步降低；(3)應用大量的免疫抑制劑，可引起Treg細胞百分比降低。本研究觀察到隨著移植術成功至6周開始出現Treg細胞的表達，表達范圍在0～1%，由于時間短暫，患者出院，未能繼續跟蹤，但從移植后來院復查的患者中觀察到，Treg細胞在移植半年到5年后，表達范圍在3%～11%。

器官移植前CD4+CD25+CD127lowTreg細胞占CD4+T淋巴細胞百分比與TGF-β1、IL-10水平呈正相關，差異有統計學意義，與于丹軍等[7]在婦科腫瘤研究結果相一致。表明Treg 可能通過引起TGF-β、IL-10 上調而發揮免疫抑制的作用。

移植患者TGF-β1、IL-10的水平下降，移植前高于移植后，但經統計分析，差異無統計學意義(P>0.05)。可能與移植前患者體內存在的TGF-β1、IL-10水平有關。具體機制尚不清楚，有待進一步的觀察研究。

4 結 論

Treg細胞及細胞因子在器官移植免疫中發揮著重要的作用，本研究觀察Treg細胞與細胞因子TGF-β1、IL-10水平在移植前呈正相關。Treg細胞在移植后數周下降為0，幾周后緩慢出現表達，細胞因子移植后下降。臨床中有關Treg細胞與細胞因子在移植前后監測的數據稀少，還需要更多的研究來明確這類細胞作為一種免疫指標的作用。