妊娠期糖尿病孕婦外周血胎兒游離DNA檢測及其臨床意義1

江 鴻，費(fèi)安興，魏莉平，鄒甜甜，何 松，李 勝

(鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖北黃石 435000)

國際糖尿病協(xié)會權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，糖尿病的發(fā)病呈快速增長和低齡化的態(tài)勢，已躍居全世界發(fā)病率和病死率最高的疾病之一。全球糖尿病患者在2010年已接近3億，預(yù)計(jì)到2030年將超過4.35億，糖尿病及并發(fā)證已成為全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的健康問題。糖尿病將成為世界經(jīng)濟(jì)增長的主要牽制力之一，這顯示了全球糖尿病防治的嚴(yán)峻形勢。

妊娠期糖尿病(GDM)是指在妊娠期間首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的葡萄糖耐量異常，是糖尿病的一種特殊類型，其發(fā)病率在各國差異較大，為1%～14%。GDM對孕婦、胎兒和新生兒均有較大的負(fù)面影響，GDM患者中羊水過多、妊娠期高血壓、巨大兒、剖宮產(chǎn)、胎兒畸形、新生兒低血糖、低血鈣、新生兒窒息甚至死亡的發(fā)生率明顯增高，GDM產(chǎn)婦自己發(fā)展為2型糖尿病的概率也會大大增加，且其分娩的子女(特別是出生時(shí)為巨大兒的子女)成年后發(fā)生肥胖及2型糖尿病等代謝性疾病的概率也會顯著增高，這種遺傳效應(yīng)導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病具有明顯的家族聚集性，這對患者的整個(gè)家庭乃至整個(gè)社會都會造成極大的影響[1-3]。本研究以黃石地區(qū)孕婦人群為研究對象，通過高通量技術(shù)平臺，檢測GDM孕婦外周血胎兒游離DNA，篩選孕婦妊娠期胎兒染色體非整倍數(shù)拷貝變異，為進(jìn)一步解析影響妊娠期孕婦糖尿病致病基因的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1-6月來鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院圍保門診產(chǎn)檢的GDM孕婦的靜脈血樣本作為GDM組，共15例；健康對照組為體檢健康孕婦，共15例。孕婦年齡22～35歲，孕周12～26周。GDM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第6版[4]和國家原衛(wèi)生部妊娠期糖尿病的篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn)(2011年)[5]。GDM組孕婦與健康對照組均為單胎，年齡、孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，所有健康對照組孕婦體檢健康，無高血壓、糖尿病史等其他既往病史。本研究經(jīng)鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)(1.0版，2018-12-24)。

1.2方法

1.2.1血漿DNA抽提 GDM組是血糖耐受量異常組，健康對照組是正常血糖濃度組。通過采集孕婦外周靜脈血10 mL左右，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，1 500 g離心10 min，取分離得到的母體血漿進(jìn)行胎兒游離DNA提取，參照華大基因核酸提取試劑盒進(jìn)行操作。首先，配置蛋白酶K溶液，在96孔內(nèi)按照1∶10比例加入蛋白酶K和磁珠液，用封口膠密封，50 ℃恒溫振蕩器中250 r/mim洗脫1 h。然后，在每孔內(nèi)加入20 μL磁珠和400 μL binding buffer震蕩2～3 min混勻，放置磁力架中5 min，倒掉上清；分別用600 μL洗脫液離心5 min混勻，放置磁力架中5 min，倒掉上清。最后，每孔加入50 μL Elution Buffer 1 300 r/min，70 ℃，20 min，放置于磁力架中獲得DNA溶液。DNA質(zhì)量檢測是通過Qubit 4熒光定量儀上測定DNA濃度和總量，吸光度(A)260/280在1.8～2.0。

1.2.2cDNA合成及文庫構(gòu)建 采用華大基因BGI NIFT檢測試劑盒的建庫方法構(gòu)建cDNA文庫，具體步驟如下：對血漿提取的DNA通過末端修復(fù)、接頭連接、PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫制備；制備陰性對照和陽性對照混合液，分別取38.5 μL分子級水，再分別加入1.5 μL陰性對照品、陽性對照品，充分混勻。制備10.0 μL末端修復(fù)液，其中末端修復(fù)酶0.6 μL，末端修復(fù)緩沖液9.4 μL。將上述PCR管加入10 μL末端修復(fù)混合液，充分混勻，瞬間離心，置于PCR儀上，37 ℃孵育10 min，冷卻至4 ℃保存；接頭連接采用磁珠法，將總體積30 μL的連接反應(yīng)混合液(24 μL連接緩沖液，1 μL連接酶和5 μL標(biāo)簽接頭)加入PCR管內(nèi)，置于PCR儀上23 ℃孵育20 min，冷卻至4 ℃保持；再將PCR管過磁力架，棄掉上清液后，加入200 μL 75%乙醇，吹打混勻，過磁力架至溶液澄清，棄掉上清；加入23 μL洗脫緩沖液，充分混勻，室溫靜置5 min，置于磁力架3 min至溶液澄清，取21 μL上清液于新PCR管中。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃，2 min，1個(gè)循環(huán)；98 ℃，15 s，56 ℃，15 s，72 ℃，30 s，12個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)，4 ℃，保存。以文庫濃度≥2 ng/μL為合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3上機(jī)檢測 對構(gòu)建好的cDNA文庫經(jīng)純化合格后，使用BGISEQ-50測序平臺測序。

2 結(jié) 果

2.1測序質(zhì)量質(zhì)控分析 每次檢測樣本測序有效數(shù)據(jù)量不少于3.5 M條DNA序列，每次檢測結(jié)果同時(shí)滿足陰性對照品檢測為陰性，陽性對照品檢測為陽性結(jié)果。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)定為45個(gè)循環(huán)，隨著循環(huán)數(shù)增加，唯一比對測序條帶數(shù)>2.5 M，Q20達(dá)到95%以上，Q30均達(dá)到90%以上，GC%含量在38%～42%，可見數(shù)據(jù)質(zhì)控合格，可以進(jìn)行下一步結(jié)果分析，見圖1。

注：A表示基因芯片參數(shù)；B表示基因序列讀取結(jié)果；C表示標(biāo)簽拆分率。

圖1測序質(zhì)控圖

表1 GDM組和健康對照組孕婦胎兒游離DNA文庫濃度比較(ng/μL)

2.22組孕婦外周血胎兒游離DNA文庫濃度比較 GDM組孕婦和健康對照組孕婦胎兒游離DNA文庫濃度分別為(17.60±0.70)、(18.20±0.35)ng/mL，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.32組孕婦外周血胎兒染色體拷貝數(shù)結(jié)果分析 采用Z檢驗(yàn)驗(yàn)證GDM組與健康對照組，結(jié)果顯示，當(dāng)陽性判斷值判斷為3時(shí)，顯著性水平P<0.01，Z<3，可判定為陰性，并且GDM組和健康對照組間染色體拷貝數(shù)無明顯差異。見表2。

表2 GDM組和健康對照組孕婦胎兒游離DNA染色體非整倍體拷貝數(shù)及風(fēng)險(xiǎn)值

3 討 論

關(guān)于GDM的發(fā)病機(jī)制學(xué)說眾多，有遺傳易感學(xué)說、胰島素抵抗學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、細(xì)胞因子分布及表達(dá)異常學(xué)說等，其中，胰島素抵抗(IR)普遍被認(rèn)為是導(dǎo)致GDM發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制[6-7]。大量研究表明，糖尿病是一種多基因病，GDM是糖尿病中的獨(dú)立類型，對孕婦和胎兒均存在重大影響，GDM不僅與生理性代謝相關(guān)，起決定性作用的仍然是易感基因和致病相關(guān)基因[8-10]。因此，本研究旨在通過檢測GDM孕婦外周血胎兒游離DNA變化，分析基因表達(dá)水平是否正常，為診斷和闡明GDM及其遺傳效應(yīng)提供依據(jù)。

近年來，國內(nèi)外廣泛提出了“精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃”，特別是伴隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基因測序的成本日益降低，基因測序技術(shù)日漸在腫瘤檢測、液體活檢和產(chǎn)前診斷等諸多領(lǐng)域凸顯重要價(jià)值和應(yīng)用前景[11-13]。本研究中通過華大基因BGISEQ-50測序儀，采用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS)和DNA納米球(DNB)技術(shù)，將DNA分子錨與熒光探針在DNB納米球上進(jìn)行聚合，并產(chǎn)生熒光信號，然后通過高分辨率成像系統(tǒng)對光信號進(jìn)行拍照采集，光信號經(jīng)過數(shù)字化處理后即可獲得堿基序列。其中，DNB 通過線性擴(kuò)增的方法進(jìn)行增強(qiáng)信號，這種方法可以有效降低單拷貝的錯(cuò)誤率[14]，十分有效地保證測序過程的準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)均設(shè)置對照組及質(zhì)控，測序結(jié)果顯示有效測序量達(dá)到5 M以上，測序飽和量均達(dá)到要求，兩組Q20和Q30均分別高于90%以上，GC含量均在50%范圍內(nèi)，由此證明測序結(jié)果十分可靠。

正常母親和胎兒的染色體基因在表達(dá)水平上是相同的，如果出現(xiàn)孕婦或胎兒染色體基因表達(dá)水平異常，那么可能與一些先天性疾病發(fā)生密切相關(guān)。湯冬玲[15]的研究表明，GDM就可能與基因表達(dá)水平異常直接相關(guān)，游離胎兒DNA水平的升高可能與GDM的病理變化使胎盤屏障不完善，胎兒有核細(xì)胞進(jìn)入母體量增多有關(guān)。因此，孕婦外周血中胎兒DNA水平的改變可作為輔助診斷及預(yù)防 GDM的一項(xiàng)有效指標(biāo)。本研究采用無創(chuàng)孕婦外周血游離DNA測序技術(shù)，理論上可以通過檢測游離在母體外周血的胎兒DNA來檢測胎兒的遺傳物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)零風(fēng)險(xiǎn)的遺傳檢測。已有大量報(bào)道顯示，無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)準(zhǔn)確性高，基本接近產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，具有非侵入性、無流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢，其綜合先進(jìn)的生物信息學(xué)分析技術(shù)，準(zhǔn)確檢測出常見胎兒染色體非整倍體異常[16-18]。本研究顯示，GDM組孕婦胎兒游離DNA文庫濃度并無顯著異常，但進(jìn)一步通過染色體非整倍體變異分析發(fā)現(xiàn)個(gè)別在18號染色體基因拷貝數(shù)存在微重復(fù)，但是否與糖尿病致病相關(guān)仍有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究通過高通量技術(shù)揭示，GDM孕婦外周血胎兒游離DNA無明顯異常，染色體基因拷貝數(shù)無明顯差異，為進(jìn)一步研究GDM形成的分子機(jī)制和臨床診斷奠定了基礎(chǔ)。