異常免疫表型模式在急性髓系白血病微小殘留檢測中的應(yīng)用1

母 璨，葉遠馨，應(yīng)斌武

(四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科,四川成都 610041)

急性髓系白血病是髓系造血干/祖細胞克隆性惡性增殖的血液系統(tǒng)疾病，以髓系原始細胞和幼稚細胞的惡性增殖為主要特征。雖然其臨床緩解率可達80%以上[1]，但僅30%～40%的年輕患者和不及20%的老年患者能達到長期無病生存[2-4]。復發(fā)仍是困擾白血病治愈的一個難點。而形態(tài)學方法評價療效及預后存在不足，治療后達到完全緩解的患者中很多人會在不同時間間隔后復發(fā)。此時微小殘留病(MRD)檢測的出現(xiàn)為解決這一臨床問題提供了可能性。MRD是指白血病患者經(jīng)誘導化療或骨髓移植獲得形態(tài)學完全緩解后體內(nèi)仍殘存的形態(tài)學上不能檢測到的少量白血病細胞。隨著技術(shù)的進步,MRD檢測方法呈現(xiàn)多樣化,檢測的靈敏度也不斷提高[5]。MRD檢測有利于更早地預測白血病的復發(fā)，指導白血病的臨床治療，根據(jù)體內(nèi)白血病細胞多少以決定是繼續(xù)化療抑或停止治療；有利于較早發(fā)現(xiàn)白血病細胞是否耐藥，并依此指導臨床選用更靈敏、更具殺傷力的治療措施[6]；有助于評價骨髓移植后的緩解率及自體造血干細胞移植的凈化效果[7]。

部分白血病通過PCR技術(shù)檢測特定基因異常來檢測MRD[8]。因此，PCR技術(shù)對于急性白血病MRD檢測具有一定意義。但部分急性髓系白血病目前本身尚不能檢測到基因異常[9]，并且對每一位初診的急性白血病患者均要篩選出特定基因異常其成本較高。因此，建立流式細胞術(shù)檢測急性白血病患者MRD的方法仍是必要的。

本研究旨在采用流式細胞術(shù)對正常骨髓髓系原始細胞和急性髓系白血病細胞免疫表型進行分析，探討急性髓系白血病細胞異常免疫表型模式和用于MRD檢測的抗體組合，建立以多色流式細胞術(shù)檢測急性髓系白血病MRD的方法，并探討其對疾病復發(fā)監(jiān)測的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 實驗對象為四川大學華西醫(yī)院2017年6月至2018年6月就診的患者。其中初診時確診為急性髓系白血病患者346例，初診時已進行全面免疫表型分析且臨床已明確急性白血病亞型，在行誘導化療后及鞏固化療長期隨訪監(jiān)測過程中可抽取骨髓標本進行MRD檢測的患者58例，非惡性血液系統(tǒng)疾病患者20例。采用肝素鈉抗凝真空采血管收集患者新鮮骨髓標本，按照熒光抗體試劑配套的操作說明書標記、處理、檢測所需抗原。所有急性髓系白血病患者診斷、分類標準參照《WHO造血和淋巴組織腫瘤分類》(2016版)。完全緩解標準參照《血液病診斷及療效標準》。

1.2儀器與試劑 熒光標記的單克隆抗體試劑均購自美國BD公司。除此之外還使用了BD公司穿孔素、磷酸鹽緩沖液(PBS)、氯化銨溶血劑。本實驗采用BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀、低速離心機、BD Diva流式分析軟件。

1.3方法 本研究檢測了20例非惡性血液系統(tǒng)疾病患者骨髓標本中髓系原始細胞的免疫表型(相關(guān)抗原標記包括CD2、CD5、CD7、CD13、CD15、CD19、CD33、CD34、CD38、CD117、CD56、CD14、CD64、HLA-DR)，以建立正常髓系原始細胞免疫表型模式。收集346例初診急性髓系白血病患者骨髓標本，分析白血病細胞異常免疫表型，包括：(1)抗原跨系表達；(2)跨階段表達；(3)過度表達及缺失表達。收集58例 MRD患者骨髓標本，分析其殘留情況。對于急性髓系白血病患者，評估的抗體組合主要包括：CD15/CD13/CD33/CD34/CD45，CD56/CD117/CD38/CD34/CD45， CD7/CD117/CD19/CD34/CD45，CD2/CD117/CD5/CD45，CD64/CD117/CD14/CD34/HLA-DR/CD45。組合方式可以視初診時免疫表型而定。對于流式細胞術(shù)MRD檢測結(jié)果陽性而細胞形態(tài)學陰性的患者(尚在誘導化療期的患者除外)，觀察其后期臨床緩解和復發(fā)情況。

2 結(jié) 果

2.1正常骨髓的髓系原始細胞免疫表型 在CD45/SSC散點圖上，20例非惡性血液系統(tǒng)疾病患者骨髓標本中原始細胞區(qū)細胞主要為CD117陽性髓系原始細胞，其在有核細胞中所占比例為2.51%±0.84%，這類CD117陽性原始細胞共表達抗原陽性率如下：CD64+為11.2%±6.80%，CD7+為2.7%±3.50%，CD19+為0.11%±0.13%，CD5+為0.08%±0.09%，HLA-DR+為90.61%±8.77%，CD14+為0.09%±0.11%。還有部分原始細胞區(qū)細胞為CD34陽性髓系原始細胞，其在有核細胞中所占比例為1.21%±0.83%，這類CD34陽性原始細胞共表達抗原陽性率如下：CD13+/CD33+為72.6%±11.80%，CD13+/CD33-為22.3%±13.90%，CD56+為1.31%±1.08%，CD64+為0.16%±0.09%，HLA-DR-為0.11%±0.08%，CD15+為1.4%±0.10%，CD38+為97.2%±4.50%。

對于單核細胞，主要觀察了CD13/CD33、CD14/CD64的表達，單核細胞群中CD13+/CD33+、CD14+/CD64+細胞分別占單核細胞的99.08%±1.32%和97.75%±1.71%。

2.2急性髓系白血病細胞免疫分型 本研究分析了346例急性髓系白血病的白血病細胞免疫表型[急性早幼粒細胞白血病(APL)除外]，出現(xiàn)異常免疫表型的有314例(占90.8%)。在本研究所涉及的抗原標志物中，跨系表達有5類，抗原表達強度變化或缺失有7類，跨階段表達有3類。各類抗原異常表達在急性髓系白血病中出現(xiàn)的陽性率見表1。

表1 急性髓系白血病抗原異常表達及其陽性率

在表1中，急性髓系白血病常見異常免疫表型為CD7+/CD117+和CD34+/CD56+。其散點圖見圖1。以成熟淋巴細胞為參照，原始細胞分別出現(xiàn)在圖1A和圖1B的Q2象限中，為異常原始細胞，兩者均為抗原跨系表達。

2.3急性髓系白血病MRD檢測 研究對象中58例急性髓系白血病患者共進行了173次MRD檢測，與骨髓細胞形態(tài)學分析相比較，采用χ2檢驗對結(jié)果進行分析，χ2=24.735，P=0.00。細胞形態(tài)學原始細胞比例>5%而流式細胞術(shù)為陰性的2次結(jié)果中，原始細胞免疫表型均無明顯異常，臨床亦無明顯復發(fā)的證據(jù)。流式細胞術(shù)陽性結(jié)果中原始細胞比例>5%的有36次，其中2次形態(tài)學結(jié)論為陰性；原始細胞比例<5%的有41次，其中30次形態(tài)學結(jié)論為陰性。

注：紅色表示髓系原始細胞；綠色表示成熟淋巴細胞。

圖1急性髓系白血病常見異常免疫表型CD7+/CD117+及CD34+/CD56+

2.4臨床觀察 在1年觀察期內(nèi)，流式細胞術(shù)檢測MRD陽性而細胞形態(tài)學陰性的患者復發(fā)率為69.23%(18/26)；流式細胞術(shù)及細胞形態(tài)學均為陰性的患者復發(fā)率為15.63%(5/32)，明顯低于流式細胞術(shù)檢測MRD陽性病例。

2.5分子生物學結(jié)果比較 在上述173次MRD檢測中有73次進行了流式細胞術(shù)、PCR融合基因檢測，且初診時兩者均為陽性，其中APL 22例，非APL 51例。有65例2種檢測結(jié)果一致，占89.04%(65/73)，具體分析見表2。有8例兩者結(jié)果不一致的情況，其中+/-組合1例為APL，-/+組合中7例均為APL。

表2 急性髓系白血病流式細胞術(shù)MRD和PCR結(jié)果患者符合例數(shù)比較(n)

3 討 論

急性白血病惡性克隆細胞抗原的表達具有很大的異質(zhì)性。急性髓系白血病的流式細胞術(shù)診斷有賴于原始細胞比例的明顯增加和克隆性白血病細胞的異常免疫表型特征作為依據(jù)[10]。本實驗對比分析正常骨髓髓系原始細胞和白血病細胞上的多種免疫表型，以提高對原始細胞的分辨率，并發(fā)現(xiàn)不同于正常細胞的腫瘤性原始細胞群，即免疫表型模式分析。

隨著相關(guān)文獻的報道，人們對各類抗原分子的認識也在不斷更新。CD117是急性髓系白血病相對較特異的免疫標志物，在急性髓系白血病-M0/M1/M2/M4中均可表達[11]。CD34亦可作為髓系原始細胞標記，但其表達范圍不及CD117廣泛，主要見于早期髓系原始細胞，并需注意排除B祖細胞干擾，當患者出現(xiàn)耐藥時CD34表達水平升高[12]。CD13、CD33、CD38在早期髓系原始細胞即可出現(xiàn)。CD15、CD64主要表達于較成熟的粒細胞和單核細胞，在早幼粒細胞和原幼單核細胞亦可部分表達，但在原始粒細胞中少見表達。CD14是較特異的單核細胞標志物，表達于成熟單核細胞，亦存在極少量幼稚單核細胞。CD117少量表達于幼稚單核細胞[11]，不表達于成熟單核細胞。CD7的表達范圍較廣，正常情況下可表達于極早期的髓系原始細胞，其表達程度隨細胞發(fā)育逐漸減弱。CD56抗原是一種神經(jīng)細胞黏附分子，在血液腫瘤及實體腫瘤中均可表達[13]。正常骨髓中難以見到表達CD2、CD5或CD19的髓系原始細胞。

對于本研究關(guān)注的3類抗原表達異常中，白血病性原始細胞跨系表達是較常見的一種異常免疫表型特征。急性髓系白血病常見的跨系表達是T淋巴細胞的抗原標志CD7和B淋巴細胞抗原標志CD19。CD56亦是急性髓系白血病常見的抗原標志，但其作為跨系表達的意義不及CD7和CD19，因為化療后增生的正常原始粒細胞亦可見CD56表達。白血病細胞另一異常特征是出現(xiàn)原始細胞抗原和后期較成熟細胞抗原共表達。本研究中CD15是急性髓系白血病中最常見的與原始細胞抗原共表達的抗原標志。CD64、CD14與原始細胞標志共表達的發(fā)生率均較低。除此之外，白血病細胞抗原表達強度也可表現(xiàn)出與其發(fā)育階段不相符合的情況。CD13、CD33、CD38、HLA-DR均可發(fā)生表達強度變化。而CD13、CD33因為在正常原始細胞亦為部分表達，故在MRD檢測時可能難以明確區(qū)分少量CD13/CD33表達異常的白血病細胞和混雜的正常原始細胞。對于抗原表達強度變化的正確判斷還有賴于標本處理過程的一致性和儀器狀態(tài)、參數(shù)設(shè)置的穩(wěn)定性。

白血病細胞異常表達的抗原不僅在初發(fā)的白血病細胞中可以檢測到，而且在治療后達到形態(tài)學完全緩解時，殘存的白血病細胞多數(shù)仍保留其初發(fā)時的抗原異常表達[14]，這保證了流式細胞術(shù)檢測白血病MRD的臨床實用性。本研究結(jié)果顯示，選擇合適的免疫表型模式進行分析，可為臨床急性髓系白血病病例提供較準確的MRD檢測結(jié)果。流式細胞術(shù)方法與細胞形態(tài)學相比，流式細胞術(shù)MRD檢測結(jié)果陽性率明顯提高，且檢測結(jié)果與患者臨床進展相一致，流式MRD陽性者復發(fā)率較高，預后較差，被證明是兒童急性髓系白血病在誘導和鞏固治療期間復發(fā)的一個有效的獨立預后指標[15]，與PCR結(jié)果符合度為89.04%，這顯示流式細胞術(shù)檢測結(jié)果亦具有較高的靈敏度。但APL除外，絕大多數(shù)APL有PML/RARα融合基因異常，且異常免疫表型出現(xiàn)率低于非APL患者，故應(yīng)以PCR作為其MRD檢測的首選方法。同一種抗原采用不同顏色熒光標記的檢測效率可能存在差異，但因本實驗室采用的抗體熒光顏色相對固定，在此沒有進一步探討。本文選取的研究對象為四川大學華西醫(yī)院就診患者，由于實驗對象的局限性，需要進一步擴大樣本量和研究區(qū)域來驗證本文實驗結(jié)果。

4 結(jié) 論

急性髓系白血病具有明顯不同于正常來源原始細胞的異常免疫表型特征，適合于采用流式細胞術(shù)進行白血病MRD檢測。當殘留的白血病細胞>5%時，骨髓細胞形態(tài)學和流式細胞術(shù)結(jié)果吻合度高，流式細胞術(shù)可以作為前者的補充；但當殘留的白血病細胞<5%時，使用流式細胞術(shù)MRD檢測方法具有較高的靈敏度，在考慮患者的經(jīng)濟狀況情況下，流式細胞術(shù)是檢測MRD的重要手段。并且和分子生物學結(jié)果吻合度高(APL患者除外)，能更準確地反映體內(nèi)白血病細胞負荷和病情變化，提示患者復發(fā)風險，指導臨床治療方案調(diào)整。