IL-17基因多態(tài)性與支氣管哮喘患兒血清TIgE、ECP的關系分析

陶麗芳，張 潔，陸利芳，顧震宇

(蘇州市第九人民醫(yī)院新生兒科，江蘇蘇州 215200)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒科常見的氣道慢性炎癥性呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為支氣管痙攣、可逆性氣道阻塞及氣道重構(gòu)，其發(fā)病機制復雜，至今仍未能完全闡明[1]。但哮喘本身是IgE所介導的Ⅰ型變態(tài)反應性疾病，其主要癥狀誘因多以過敏為主，當機體受體接觸變應原時，B淋巴細胞便可合成IgE，并與其他效應細胞、肥大細胞表面的IgE受體結(jié)合，當再次接觸變應原時，后者則與IgE受體復合物交聯(lián)結(jié)合，觸發(fā)效應細胞脫顆粒，釋放組胺及其他炎性介質(zhì)，導致氣道高反應性并引發(fā)哮喘[2-3]。而嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)則是嗜酸性粒細胞的特異性標志，其細胞毒性作用極強，不僅可引起氣道高反應性，誘導喘息發(fā)作，并能加重變態(tài)反應炎癥過程。有研究指出，IL-17基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘易感性具一定關聯(lián)性，但研究IL-17基因多態(tài)性與哮喘患兒血清總IgE(TIgE)、ECP的臨床報道相對少見[4-5]。鑒于此，本研究著重探究IL-17基因多態(tài)性與哮喘患兒血清TIgE、ECP的關系，旨在為哮喘的臨床防治提供參考意見，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2018年1-12月收治的60例哮喘患兒納入研究，設為哮喘組；另選取同期于本院行健康體檢的60例健康兒童作為對照組。哮喘組男38例，女22例，年齡6～12歲，平均(9.74±1.20)歲；對照組男32例，女28例，年齡6～13歲，平均(10.01±0.97)歲。2組研究對象性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.234，P=0.266；t=1.355，P=0.177),具有可比性。

1.2納入、排除標準 納入標準：(1)哮喘組患兒均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中哮喘診斷要求；(2)對照組均為健康兒童，既往亦無哮喘病史及家族史、過敏性疾病病史及家族史；(3)患兒監(jiān)護人或家屬知情研究內(nèi)容并自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)炎癥性腸道疾病；(2)哮喘以外的肺部疾病，如支氣管肺擴張、肺炎等；(3)非哮喘所致的免疫功能缺陷疾病；(4)結(jié)締組織疾病；(5)其他能引起IL-17A-152G/A位點、IL-17F 7488T/C位點突變的疾病。

1.3方法

1.3.1IL-7基因多態(tài)性 IL-17A-152G/A位點(上游：5′-CAG AAG ACC TAC ATG TTA CT-3′；下游：5′-GTA GCG CTA TCG TCT CTC T-3′IL-17F 7488T/C位點(上游：5′-GTG TAG GAA CTT GGG CTG CAT CAA T-3′；下游：5′-AGC TGG GAA TGC AAA CAA AC-3′)引物均由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司合成。采集研究對象空腹外周靜脈血后，2 500 r/min條件下離心5 min后吸取上清液，置于-20 ℃冰箱保存；巴氏滴管將余下凝血塊搗碎并轉(zhuǎn)移至液化柱CX1中12 000 r/min條件下離心5 min，參照文獻[6]提取全血DNA，核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度及純度。雙面超凈工作臺配置PCR反應體系，PCR儀為2720 Thermal lycler PCR儀、96-WellThermal Cycler PCR儀；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測IL-17A-152G/A基因PCR產(chǎn)物；再于雙面超凈工作臺配置PCR產(chǎn)物酶切反應體系，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物酶切產(chǎn)物，G∶BOX凝膠成像系統(tǒng)拍照后觀察保存，并分析結(jié)果。IL-17F 7488T/C位點的多態(tài)性檢測參照L-17A-152G/A位點。所有步驟均嚴格按試劑盒說明書、標準操作程序操作[5]。

1.3.2血清TIgE、ECP檢測 采集研究對象的空腹外周靜脈血，應用貝克曼庫爾特免疫比濁試劑盒檢測血清TIgE水平，儀器為IMMAGR 800特定蛋白分析儀。ECP則采用人ECP酶聯(lián)免疫試劑盒檢測。

1.4觀察指標 統(tǒng)計2組IL-17A-152G/A位點、IL-17F 7488T/C位點基因型頻率及等位基因頻率,比較2組血清TIgE、ECP水平及IL-17A-152G/A位點、IL-17F 7488T/C位點不同基因型間血清TIgE、ECP水平。

2 結(jié) 果

2.12組基因型頻率及等位基因頻率比較 哮喘組IL-17A-152G/A位點、IL-17F 7488T/C位點基因型頻數(shù)、等位基因頻數(shù)頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。哮喘組中IL-17A-152G/A位點中AA基因型頻數(shù)頻率、A等位基因頻數(shù)頻率均顯著高于對照組；IL-17F 7488T/C位點中TT型基因頻數(shù)頻率、T等位基因頻數(shù)頻率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 IL-17A-152G/A位點基因型頻率及等位基因頻率[n(%)，n=60]

表2 IL-17F 7488T/C位點基因型頻率及等位基因頻率[n(%)，n=60]

2.22組血清TIgE、ECP水平比較 哮喘組血清TIgE、ECP水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

2.3IL-17A-152G/A位點不同基因型間血清TIgE、ECP比較 哮喘組IL-17A-152G/A位點不同基因型血清TIgE比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);AA型基因血清TIgE顯著高于AG、GG型(P<0.05)，但血清ECP比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而對照組不同基因型血清TIgE、ECP比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 IL-17A-152G/A位點不同基因型間血清TIgE、ECP比較

2.4IL-17A-152G/A位點不同等位基因間血清TIgE、ECP比較 IL-17A-152G/A位點A等位基因攜帶患兒血清TIgE顯著高于非A等位基因攜帶患兒，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 IL-17A-152G/A位點位點不同等位基因間血清TIgE、ECP比較

2.5IL-17F 7488T/C位點不同基因型間血清TIgE、ECP比較 IL-17F 7488T/C位點不同基因型間血清TIgE、ECP比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 IL-17F 7488T/C位點不同基因型間血清TIgE、ECP比較

2.6IL-17F 7488T/C位點不同等位基因間血清TIgE、ECP比較 哮喘組IL-17F 7488T/C位點不同等位基因間血清TIgE、ECP水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表7。

表7 IL-17F 7488T/C位點不同等位基因間血清TIgE、ECP比較

3 討 論

近年來，哮喘易感基因已成為臨床研究熱點。IL-17基因多態(tài)性被證實與多種疾病相關，如張海森等[7]報道，IL-17A G-197A多態(tài)性與國內(nèi)漢族人群骨關節(jié)炎的易感性相關，陽性位點rs2275913等位基因G/A、G/G是骨關節(jié)炎高風險因素，A/A則為低風險因素。裴芳等[8]研究顯示，IL-17A基因rs2275913位點SNP可能與中國重慶地區(qū)漢族人群病毒性心肌炎(VMC)有關，A等位基因是VMC的易感基因。IL-17A基因、IL-17F基因均位于6p12，長度分別為4 252 bp、7 815 bp。前者是極具潛力的與哮喘易感性有關的候選基因，其SNP位點多位于非編碼區(qū)，與后者不僅在結(jié)構(gòu)上極為相似，在調(diào)控、信號通路上也非常相似。既往有研究指出，IL-17A、IL-17F可形成同源二聚體及異二聚體并發(fā)揮相應功能[9]。

本研究所分析的IL-17A-152G/A位點、IL-17F 7488T/C位點分別為IL-17A基因啟動子區(qū)域、第3個外顯子區(qū)。結(jié)果顯示，哮喘組中IL-17A-152G/A位點中AA型基因頻數(shù)頻率、A等位基因頻數(shù)頻率，IL-17F 7488T/C位點中TT型基因頻數(shù)頻率、T等位基因頻數(shù)頻率均顯著高于對照組(P<0.05)，提示變異等位基因A攜帶患兒哮喘風險更高，尤其是突變純合子AA基因型，野生型TT純合子與哮喘也有一定關聯(lián)性，有C等位基因患兒或具有更低的哮喘風險。這與羅薩[10]的報道結(jié)論存在一定差異，其認為IL-17A-152G/A位點基因多態(tài)性與哮喘無明顯相關性，基于研究在樣本數(shù)量上的差異性，IL-17A-152G/A位點基因多態(tài)性與哮喘的關系仍有待采集更大樣本量、設計更嚴謹?shù)难芯糠桨负筮M一步補充及完善。

TIgE則可與炎癥細胞結(jié)合后釋放多種生物活性介質(zhì)，引起支氣管平滑肌收縮，增加黏液分泌及血管通透性，引起炎癥細胞浸潤，最終并發(fā)一系列哮喘癥狀[11-12]。而ECP作為單鏈堿性含糖蛋白質(zhì)，主要由EOS活化、中性粒細胞活化后釋放，是具細胞毒性、纖維化的多功能蛋白物質(zhì)，在變態(tài)反應中發(fā)揮重要作用，既往研究亦指出其可引起氣道上皮細胞受損、脫落基底膜及平滑肌增厚等多種病理生理改變，最終導致氣道反應性增高、支氣管痙攣及肺功能受損[13-14]。本研究顯示，哮喘組患兒TIgE、ECP水平顯著高于對照組，進一步分析不同基因型患兒血清TIgE、ECP水平，結(jié)果顯示哮喘組IL-17A-152G/A位點AA型基因血清TIgE顯著高于AG、GG型，但血清ECP比較差異無統(tǒng)計學意義，提示IL-17A基因突變純合子-152AA基因型或與血清TIgE升高有關，A等位基因攜帶患兒血清TIgE升高更顯著，這與曾艷[15]的報道結(jié)論相似。同時，雖哮喘患兒在IL-17F 7488T/C位點基因型分布、血清TIgE及ECP水平上與對照組比較差異有顯著性，但IL-17F 7488T/C位點不同基因型間血清TIgE、ECP比較差異無統(tǒng)計學意義，提示IL-17F 7488T/C位點與血清TIgE、ECP無明顯關聯(lián)。

4 結(jié) 論

綜上所述，IL-17A-152G/A基因多態(tài)性與哮喘易感性有關，變異等位基因A攜帶患兒哮喘風險更高，尤其是突變純合子AA基因型，野生型TT純合子與哮喘也有一定關聯(lián)性，值得臨床重視。但基于本研究在樣本數(shù)量上的局限性，部分基因型分布例數(shù)不足10例，可能存在一定統(tǒng)計學誤差。因此，IL-17基因多態(tài)性與哮喘患兒血清TIgE、ECP的相關性仍有待擴大樣本量后深入探究。