乙型肝炎患者e抗原轉換與外周血γδT和Tc17的關系1

尹凌凡，王夢潔，熊建輝，孫黎輝

(深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院/北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518111)

乙型病毒性肝炎是一種世界性的傳染病，其發(fā)病機制極為復雜，病變主要由細胞免疫異常所致，與體內(nèi)多種免疫細胞的相互作用有關。在病毒清除和肝臟的炎性反應中，乙型肝炎病毒(HBV)特異性T淋巴細胞是主要的效應細胞，而CD8+T淋巴細胞在控制HBV復制和免疫介導的肝損傷中發(fā)揮重要作用[1]。其中，γδT和細胞毒性T細胞17(Tc17)細胞群在乙型肝炎的發(fā)病、轉歸和治療中起到的作用，在近年來逐漸引起重視。乙型病毒性肝炎的治療，目前主要通過抑制病毒復制和改變機體免疫狀態(tài)2個方面來進行[2]。機體免疫細胞的免疫狀態(tài)對于慢性乙型肝炎e抗原(HBeAg)轉換方向及預后有很大的影響,HBeAg是HBV在體內(nèi)活躍復制的標志之一，HBeAg的血清學轉換標志病毒復制減少，免疫耐受性減弱或病變靜息等變化[3]。本研究通過觀察慢性乙型肝炎患者外周血γδT和Tc等細胞群免疫指標與HBeAg轉換之間的關系，來了解慢性乙型肝炎患者的細胞免疫狀態(tài)及在疾病轉歸方面的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2018年4月90例在本院肝病門診就診的乙型肝炎患者作為研究組，選取同期體檢的30例健康者作為對照組。研究組患者中男47例，女43例，年齡26～61歲，平均年齡為(45.7±5.6)歲。對照組中男16例，女14例，年齡25～60歲，平均年齡(45.9±5.1)歲。本研究已通過本院倫理委員會批準。2組研究對象自愿參與本研究，并同意對其進行隨訪。研究組納入、排除標準：患者年齡在18歲以上，臨床診斷均符合2015年中華醫(yī)學會肝臟病分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，既往乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過6個月，現(xiàn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV-DNA陽性，HBeAg為持續(xù)陰性或陽性，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)持續(xù)或反復異?；蚋谓M織學檢查有肝炎病變；同時排除合并其他類型的病毒性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病等，無既往病史。健康對照組排除標準：無糖尿病、結核病、自身免疫性疾病和近期感染史;無肝炎癥狀和體征，血壓正常，心肺功能正常；HBsAg陰性，抗丙型肝炎病毒(HCV)陰性。研究組亞組分析： 乙型肝炎患者HBeAg轉換，即HBeAg的血清學轉換定義為HBeAg轉陰且HBeAb轉陽[2]。進一步將研究組根據(jù)HBeAg血清學轉換情況分為3組：HBeAg+/Ab-組(n=30)，即未出現(xiàn)e抗原轉換者；HBeAg+/Ab+組(n=30)，即處于轉歸中間態(tài)者；HBeAg-/Ab+組，即e抗原轉換者(n=30)。

1.2主要試劑材料 APC-γδT抗體、APC-H7-CD3抗體、PerCP-Cy5-CD8抗體、PE-IL17抗體、FITC-IFN-γ抗體、FITC-CD4抗體、PE-CD4抗體、PE-CD25抗體、AF647-CD127抗體、刺激劑BD Golgiplug及相匹配的對照抗體均購自BD Pharmigen 公司。流式細胞儀BD FACS Canto Ⅱ購自美國BD公司。全自動生化分析儀貝克曼AU5800購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3細胞培養(yǎng)、染色和流式分析 所有受試者空腹8 h以上，次日清晨抽取外周靜脈血分別注入無菌普通管和肝素抗凝管，普通管靜脈血半個小時內(nèi)離心(3 600 r/min,10 min,25 ℃)取上清，PCR方法檢測血清內(nèi)HBV-DNA含量。取2 mL肝素抗凝全血與2 mL PBS混合，緩緩注入裝有2 mL Ficol分離液的試管中，進行密度梯度離心(2 000 r/min,20 min,20 ℃)，吸取單個核細胞層細胞加入10 mL PBS充分洗滌(1 500 r/min,5 min,20 ℃),用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整外周血單個核細胞(PBMC)水平為2×109/L。在培養(yǎng)基中加入BD刺激劑4 μL/管，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)6 h。刺激后的PBMCs 重懸成15 μL反應體系，加入APC-H7-CD3 抗體2.5 μL、PerCP-Cy5-CD8抗體 8 μL、APC-γδT抗體 5 μL，經(jīng)胞外染色、破膜，以50 μL反應體系加入PE-IL17抗體10 μL、FITC-IFN-γ抗體1 μL進行胞內(nèi)染色，后在流式細胞儀(BD FACS CantoⅡ)上對γδT細胞、IL-17+γδT細胞、IFN-γ+γδT細胞、IL-17+CD8細胞等進行分析。

1.4血清ALT水平檢測 所有受試者空腹8 h以上，次日清晨采集靜脈血約10 mL，采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀及其配套試劑檢測受試者血清ALT水平。ALT水平正常值為<40 U/L；反之則提示ALT異常。

2 結 果

2.1研究組和對照組PBMCs中IFN-γ+γδT細胞、IL-17+γδT細胞、IL-17+CD8細胞及γδT細胞水平對比 研究組IFN-γ+γδT細胞、γδT細胞水平、IL-17+CD8細胞要明顯高于對照組(P<0.05)，而IL-17+γδT細胞與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 研究組和對照組的γδT細胞及其亞群的對比結果

2.2慢性乙型肝炎患者HBeAg/Ab不同表達組PBMCs內(nèi)IFN-γ+γδT細胞、 IL17+γδT細胞、IL-17+CD8細胞及γδT細胞水平對比 單因素方差分析結果顯示，IFN-γ+γδT細胞、IL-17+CD8細胞、γδT細胞3個指標整體差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，研究組中，HBeAg+/Ab-組和HBeAg+/Ab+組患者PBMCs內(nèi)總γδT細胞水平要顯著高于HBeAg-/Ab+組(P<0.05)，而在HBeAg+/Ab+和 HBeAg+/Ab-組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HBeAg+/Ab+組乙型肝炎患者IL-17+CD8細胞明顯高于另外2組(P<0.05)。見表2。

表2 研究組中不同HBeAg/Ab表達組間γδT細胞和CD8細胞及其亞群的對比結果

注：與HBeAg+/Ab-組比較，aP<0.05；與HBeAg+/Ab+組比較，bP<0.05。

2.3慢性乙型肝炎患者HBeAg/Ab不同表達組血清內(nèi)HBV-DNA水平對比 單因素方差分析結果顯示，HBeAg/Ab不同表達組中，ALT正常者、ALT異常者2個亞組及匯總合計的HBV-DNA水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，HBeAg+/Ab-組慢性乙型肝炎患者血清內(nèi)HBV-DNA水平要明顯高于HBeAg+/Ab+組和HBeAg-/Ab+組(P<0.05)。見表3。

表3 研究組中不同HBeAg/Ab表達組HBV-DNA水平對比(拷貝/毫升，

注：與HBeAg+/Ab-組比較，aP<0.05；與HBeAg+/Ab+組比較，bP<0.05。

3 討 論

根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)[4]，以HBeAg+轉化為HBeAb+的血清學轉換作為臨床慢性乙型肝炎患者治療有效的滿意狀態(tài)，說明乙型肝炎病毒的病變及免疫清除呈現(xiàn)靜止狀態(tài)，同時患者血清內(nèi)的HBV-DNA含量能夠反映乙型肝炎病毒復制的程度。慢性乙型肝炎發(fā)病機制目前仍未完全闡明，一般認為，HBV雖未直接殺傷肝細胞，但卻可以引發(fā)異常的免疫應答，導致肝細胞的損傷和炎癥的發(fā)生。研究表明，淋巴細胞介導的免疫功能紊亂、免疫調節(jié)細胞及其相應的細胞因子的產(chǎn)生在這一病理損傷過程發(fā)揮重要的作用[5]。一方面，這種免疫應答過程對疾病的恢復及病毒的清除有一定的促進作用；另一方面，因為調節(jié)因子的不平衡又可以導致免疫系統(tǒng)對HBV感染細胞的應答而致使肝臟損傷[6]。固有免疫在HBV感染初期發(fā)揮作用，而特異性免疫應答在感染持續(xù)過程中發(fā)揮主要作用。

γδT細胞是參與固有免疫應答和誘導特異性免疫應答的重要細胞群[7]，其可直接識別蛋白質或抗原肽，具有迅速激活的動力學特征，可快速、有效地發(fā)揮免疫調節(jié)和應答作用。根據(jù)結構的不同，γδT細胞可分為Vγ1、Vγ2和Vγ3這3個亞型。根據(jù)功能的差異，又可將γδT細胞劃分成IFN-γ的γδT細胞(IFN-γ+γδT)、產(chǎn)生IL-17的γδT細胞(IL-17+γδT)和調節(jié)性γδT細胞等亞群[8]。 IFN-γ+γδT細胞可以生成IFN-γ，介導細胞毒效應，在抗細胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用。IL-17+γδT細胞可以分泌IL-17，刺激細胞產(chǎn)生多種細胞因子，清除病原體并介導炎性反應。CONROY等[9]的研究顯示，與對照組相比，無癥狀的慢性持續(xù)性乙型肝炎患者具有較高的Vγ1、Vγ2。另外，無癥狀患者組的Vγ2細胞表達更高水平的IFN-γ，提示IFN-γ+Vδ2細胞可能在慢性乙型肝炎病情控制中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示，γδT細胞在慢性乙型肝炎患者PBMC中的比例顯著增高，提示γδT細胞的異常表達參與慢性乙型肝炎疾病的發(fā)生發(fā)展。另外，實驗數(shù)據(jù)也顯示，研究組IFN-γ+γδT明顯高于對照組，但IL-17+γδT在研究組和對照組差異不明顯。提示γδT細胞可能主要通過IFN-γ的細胞免疫應答調節(jié)作用參與慢性乙型肝炎的進程，考慮可能的機制為IFN-γ+γδT細胞通過生成IFN-γ，誘導機體細胞免疫反應，促進效應細胞活化和增殖，對乙型肝炎病毒的清除具有種重要作用[10-11]。此外，在患者研究組內(nèi)可以觀察到γδT在HBeAg+/Ab+組與HBeAg-/Ab+組表達具有顯著差異，而在HBeAg+/Ab+和 HBeAg+/Ab-組間多無顯著性差異，提示γδT細胞在慢性乙型肝炎中HBeAg的血清學轉換作用，且其效應可能發(fā)生在血清轉換過程的后期。而IFN-γ+γδT在研究組之間并無差異，提示γδT細胞在HBeAg轉換的作用并非IFN-γ+γδT亞群引起的，可能有其他機制，考慮γδT細胞可能通過其分泌的其他細胞因子或參與的信號通路對HBeAg進行血清學轉換，這需要進一步的研究。

既往研究顯示，產(chǎn)生IL-17的細胞在多種疾病的發(fā)病機理中發(fā)揮著重要作用[12]。除了CD4細胞(Th17)外， CD8細胞也可以分泌IL-17，此類細胞被稱為“Tc17”細胞[13]。Tc17的主要功能是通過分泌IL-17、TNF和IL-22等細胞因子發(fā)揮促炎作用。與Th17細胞相似，Tc17也是一種可塑性極強的細胞，可轉化為分泌IFN-γ的類似Tc1細胞，發(fā)揮細胞毒作用[14]。

王娟華等[15]的研究顯示，重度肝損傷患者組的Tc17明顯低于輕度和無肝損傷患者組。此外，在對丙型肝炎患者的研究中也發(fā)現(xiàn)，在低炎癥活動的丙型肝炎患者的IL-17+CD8細胞明顯高于高活動性的患者，提示IL-17+CD8細胞，即Tc17細胞可能對肝炎患者起著某種保護作用[16]。本研究進一步對研究組不同分組進行比較，發(fā)現(xiàn)在處于轉歸中間態(tài)的HBeAg+/Ab+組中可以觀察到IL-17+CD8水平與轉化前后的HBeAg+/Ab-和 HBeAg-/Ab+組有顯著性差異，提示HBeAg/Ab的系統(tǒng)轉化過程與Tc17這一具有細胞毒性的T淋巴細胞密切相關。IL-17+CD8細胞的升高，提示Tc17細胞可能通過分泌相關細胞因子，如IL-17等募集、激活效應細胞至炎癥部位，促進乙型肝炎保護性抗體的產(chǎn)生，清除病原體，對肝炎患者肝臟進行保護。Tc17細胞的升高預示HBeAg/Ab的正向轉換的可能性增大，從而對乙型肝炎的病情具有一定的動態(tài)監(jiān)測作用。

復制病毒與宿主之間免疫損傷的反應為肝損傷，患者體內(nèi)的HBV-DNA含量能夠反映患者體內(nèi)病毒的復制情況，就本研究結果來看，HBeAg+/Ab-組慢性乙型肝炎患者血清內(nèi)HBV-DNA水平要明顯高于HBeAg+/Ab+組和HBeAg-/Ab+組，而HBeAg+/Ab+組的HBV-DNA也低于HBeAg-/Ab+組，但差異無統(tǒng)計學意義。提示隨著HBeAg血清學轉換的進程，HBV的復制程度及傳染性強度隨之下降；γδT和Tc17的水平在一定程度上能夠預測患者體內(nèi)HBV的復制情況。

本研究仍然存在樣本數(shù)量較少，研究不夠透徹等缺點和其他待解決的問題，γδT細胞對HBeAg血清學轉換的作用機制尚不明確，為此，筆者將會繼續(xù)進行大樣本詳細分析，爭取進一步深入研究乙型肝炎患者PBMC中IFN-γ+γδT細胞、 IL17+γδT細胞數(shù)量及γδT其他亞群與血清中HBeAg/Ab之間的相關性及其臨床意義。

4 結 論

綜上所述，血清中呈現(xiàn)HBeAg+/Ab+的慢性乙型肝炎患者外周血內(nèi)γδT和Tc17的水平較高，其理論在臨床上能夠幫助乙型肝炎患者進行早期、及時的診斷，患者能受到更有效的治療。乙型肝炎患者體內(nèi)Tc17的頻率變化對抗病毒治療的應答具有預測意義，對臨床上乙型肝炎的治療起到一定的促進作用。