采用Allergy Lateral Flow Assay檢測過敏原特異性IgE抗體的性能評價1

陳輝雄，胡海圣，羅文婷，吳澤鴻，孫寶清△

(1.廣州醫(yī)科大學，廣東廣州 510120；2.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518172；3.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應科/呼吸疾病國家重點實驗室，廣東廣州 510120)

由IgE介導的過敏反應尤為常見，如哮喘、過敏性鼻炎和食物過敏等[1-3]。目前，過敏的檢測主要有體內(nèi)皮膚試驗和體外血清學檢測2種，1959年EBRUSTER首次報道使用皮膚點刺試驗作為Ⅰ型過敏反應的一線檢測方法[4]，至今在許多國家仍被醫(yī)生首選為可靠的檢測方法。但皮膚點刺的使用較為受限，如易受操作者技術熟練程度的影響,結果判讀帶有主觀性而不能標準化及易使患者出現(xiàn)不良反應，包括皮疹、腫脹、惡心，甚至過敏性休克等[5-6]。而體外sIgE試驗不受皮膚、藥物的影響，且安全性較好[7]，因此，體外檢測sIgE是尋找臨床相關過敏原的安全快捷手段，對于過敏性疾病的診斷、治療和預防有著重要作用。體外ImmunoCAP系統(tǒng)(Thermo Fisher,Uppsala,Sweden)，因其良好的可靠性、重復性及全自動的技術，被視為體外sIgE檢測方法的“金標準”[8]，但該系統(tǒng)需要精密的儀器與熟練的操作技術，這不僅增加了患者的檢測費用，還難以在醫(yī)療條件落后的地區(qū)開展。因此，尋找簡單、快速及性價比高的過敏原sIgE篩查技術，使基層易于建立并減輕患者的經(jīng)濟負擔有著重要的幫助。膠體金法已經(jīng)廣泛用于資源缺乏或非實驗室環(huán)境中的定性、半定量和定量監(jiān)測，監(jiān)測范圍包括生物醫(yī)學、植物檢疫、獸醫(yī)、飼料/食品、環(huán)境中的病原體、藥和代謝物等。作為過敏原檢測膠體金法新工藝的代表， Allergy Lateral Flow Assay (ALFA，Dr.Fooke Laboratorien GmbH,Neuss,Germany)具有小巧、價廉等特點，且能根據(jù)需求靈活地替換過敏原并包被在一個開放式結構的Basis Set側(cè)流裝置上[9]。由于該技術較新且國內(nèi)外這方面的研究較少，因此，本研究以ImmunoCAP系統(tǒng)為“金標準”，使用ALFA技術對中國南方地區(qū)過敏性疾病患者進行過敏原檢測，探討ALFA的檢驗效能及在中國南方的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年8-12月廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應科/呼吸疾病國家重點實驗室生物資源庫100例過敏性疾病患者為研究對象，所有患者均簽署知情同意書，經(jīng)廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，倫理號為GYFYY-2016-73。患者納入標準為：(1)年齡1～75歲；(2)具有過敏相關病史或臨床癥狀，如喘息、呼吸困難，慢性的咳嗽，過敏性鼻炎如打噴嚏、流鼻涕、鼻塞或鼻癢，皮膚過敏如出現(xiàn)風團、瘙癢或蕁麻疹；(3)經(jīng)ImmunoCAP檢測血清屋塵螨、粉塵螨、熱帶無爪螨、貓毛皮屑、狗毛皮屑、蟑螂和艾蒿sIgE至少1種為陽性(≥0.35 kU/L)。排除標準：正在進行特異性免疫治療，或合并有免疫缺陷、寄生蟲感染、惡性腫瘤及免疫相關疾病的患者。

1.2方法 所有患者均使用含分離凝膠的真空采血管抽取靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上層血清標本置于-80 ℃冰箱長期存儲待測。分別同時使用ImmunoCAP 和ALFA技術對患者血清進行屋塵螨、粉塵螨、熱帶無爪螨、貓毛皮屑、狗毛皮屑、蟑螂及艾蒿過敏原sIgE的檢測，均根據(jù)廠家的儀器說明書進行操作。2種檢測系統(tǒng)根據(jù)sIgE水平劃分等級區(qū)間：0級(≤0.34 kU/L)、1級(0.35～0.69 kU/L)、2級(0.70～3.49 kU/L)、3級(3.50～17.49 kU/L)、4級(17.50～49.99 kU/L)、5級(50.00～99.99 kU/L)和6級(≥100.0 kU/L)。

1.3統(tǒng)計學處理 使用SPSS23.0 (IBM Corp.,Armonk,NY) 進行數(shù)據(jù)分析。ALFA診斷效能如特異度、靈敏度、陽性和陰性預測值的計算是以ImmunoCAP為“金標準”。總一致性=(兩者均陽性數(shù)+兩者均陰性數(shù))×100/總測試數(shù)。由于檢測例數(shù)較少時，會影響總體一致性比率，因此，檢測的總體一致性結果通過Cohen′s Kappa Analysis檢測一致性，Kappa指數(shù)解讀如下:一致性很好(0.80～1.00)、一致性好(0.60～0.79)、中等(0.40～0.59)，一般(0.20～0.39)和差(<0.20)。Weighted Cohen′s Kappa分析用于sIgE等級之間的一致性檢測，一致性系數(shù)分別以“κ”和“κw”表示；Intra-class Correlation Analysis和Kendall′s Tau Analysis分別用于sIgE水平和sIgE等級之間關系的分析；相關系數(shù)分別以“rI”和“rK”表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1一般資料 研究入組了100例過敏性疾病患者，年齡8.3～41.0歲，平均年齡為24.5歲，女性占39%。其中27%為哮喘患者，30%為過敏性鼻炎患者，22%為同時合并鼻炎和哮喘患者，19%為食物過敏患者，2%為過敏性皮炎患者。

2.2ALFA與ImmunoCAP定性檢測結果一致性情況 以ImmunoCAP為“金標準”，粉塵螨(92.7%，κ=0.56)的總一致率最好，其次為貓毛皮屑(73.7%，κ=0.43)，最差的為蟑螂(50.0%，κ=0.07)。見表1。

表1 ALFA與ImmunoCAP定性檢測結果一致性情況

注：一致性分析，aP<0.05。

2.3ALFA檢測過敏原的診斷效能 0.35 kU/L做陽性臨界值時，ALFA檢測粉塵螨的Youden指數(shù)最高，這時靈敏度為94.1%，特異度為75.0%，而熱帶無爪螨、貓毛皮屑和屋塵螨的Youden指數(shù)范圍在0.40～0.48。另外，ALFA檢測塵螨的陽性預測值均在90%以上(96.2%～98.0%)，且在檢測貓毛皮屑時有較高的陰性預測值(85.3%)。繪制受試者工作特征曲線分析顯示，粉塵螨、屋塵螨的曲線下面積均大于0.90(P<0.05)；而熱帶無爪螨和貓毛皮屑的曲線下面積分別為0.86和0.79(P<0.05)。見表2。

表2 ALFA檢測過敏原的診斷效能

注：aP<0.05。

注：A表示屋塵螨；B表示粉塵螨；C表示熱帶無爪螨；D表示貓毛；E表示狗毛；F表示蟑螂；G表示艾蒿。

圖1 ALFA與ImmunoCAP定量檢測sIgE水平散點圖

2.4ALFA與ImmunoCAP檢測結果相關性分析 分析ALFA與ImmunoCAP檢測各過敏原的等級相關性顯示，兩方法學檢測粉塵螨、屋塵螨過敏原sIgE的相關性最強(rk>0.8,P<0.05),其次為熱帶無爪螨(rk=0.72，P<0.05)，而貓毛皮屑(rk=0.55)和狗皮屑(rk=0.43)相關性較弱(P<0.05)。同時，ALFA與ImmunoCAP檢測屋塵螨、粉塵螨和貓毛皮屑時sIgE水平相關性均較好(rI> 0.8)，而熱帶無爪螨(rI=0.69,P<0.05)相關性稍差,狗毛皮屑(rI=0.58,P<0.05)相關性最弱。見圖1、表3。

表3 ALFA與ImmunoCAP檢測結果相關系數(shù)

注：經(jīng)Kendall及Intra-class相關性分析，aP<0.05。

3 討 論

ALFA技術在檢測過敏原時僅使用少量的血清/血漿，且能在面板上靈活更換個性化的多種過敏原進行快速檢測。基于以上特點，使用膠體金法的ALFA檢測系統(tǒng)已在歐洲地區(qū)廣泛使用，且歐洲地區(qū)已有研究對梯牧草、蜜蜂毒液和大黃蜂毒液過敏原sIgE的診斷效能評價，研究顯示，與ImmunoCAP法比較，ALFA系統(tǒng)診斷以上3種過敏原均有良好的靈敏度和特異度(98.2%/100.0%,100.0%/83.0%,82.0%/97.0%)[10-11]。sIgE致敏譜可由于地域、種族、文化、飲食和生活方式等出現(xiàn)差異[12]，因此，本研究評價ALFA系統(tǒng)對中國南方地區(qū)常見的吸入性過敏原sIgE的診斷效能。

ALFA與ImmunoCAP在診斷粉塵螨和貓毛皮屑過敏原sIgE致敏的總一致率(92.7%、73.7%)、陽性符合率(94.1%、72.2%)及陰性符合率(75.0%、74.4%)最好，而屋塵螨的總一致率也高達87.6%，但κ值僅為0.27，由于屋塵螨是亞洲地區(qū)的優(yōu)勢過敏原，多數(shù)患者均合并屋塵螨陽性，導致該研究納入的屋塵螨陰性例數(shù)少，這可能導致κ值下降。

目前，國際習慣將sIgE的陽性臨界值定義為0.35 kU/L[13]，以ImmunoCAP作為“金標準”對照，評價新型檢測系統(tǒng)在該臨界值的診斷效能有一定必要性，ALFA系統(tǒng)在該臨界值下診斷屋塵螨、粉塵螨、熱帶無爪螨和貓毛皮屑sIgE致敏的Youden指數(shù)均>0.40，其中以粉塵螨效果最佳(Youden指數(shù)=0.67)，且這4種過敏原曲線下面積均在0.80～0.95(P<0.05)，提示ALFA系統(tǒng)對以上過敏原具有較好的診斷價值。

相比ImmunoCAP系統(tǒng)，ALFA系統(tǒng)對狗皮屑、蟑螂和艾蒿的診斷效能較差。分析原因有2點：(1) 由于過敏原粗提物，都是來自于自然界中的動物、植物或微生物，而地域及自然環(huán)境的差異都會導致來源于自然界的過敏原致敏蛋白成分含量和活性的不同，如本研究使用中的狗過敏原，ALFA系統(tǒng)中過敏原粗體物主要致敏蛋白為狗皮脂，而ImmunoCAP主要為狗毛，所以導致檢測出現(xiàn)差異。(2)過敏原提取物沒有國際化標準，各原料和診斷試劑生產(chǎn)商都靠建立自己的室內(nèi)參考品來進行質(zhì)量控制，如蟑螂目前缺乏單一具有免疫顯性的過敏原，而且多種蟑螂過敏原的IgE應答模式復雜，導致蟑螂提取物難以標準化生產(chǎn)[14-15]。因此，臨床醫(yī)生對患者進行診斷時不能僅僅依賴過敏原檢測結果，應結合患者病史及體格檢查等進行綜合性診斷，減少漏診及誤診情況的出現(xiàn)。

粉塵螨、屋塵螨和貓毛皮屑有較好的等級一致性(κ>0.60)，但當以±1個級別視為是一致等級時，狗毛皮屑等級一致率達87.0%，而艾蒿和蟑螂也有62.8%和57.7%，提示ALFA定位是快速篩查型的檢測方法，應用±1級別的解讀更有意義。在實際臨床應用中，解讀過敏原等級探討致敏嚴重程度時，應根據(jù)臨床需求場景進行具體解讀，如需要進行特異性免疫治療的患者，結合具體的特定等級顯得十分必要，而對于僅是篩查過敏原的患者，等級的一致性重視程度可以弱化。要注意的是，對于解讀低陽性等級時，則需考慮結果對患者臨床癥狀及病史進行綜合性判定。

本研究首次應用ALFA系統(tǒng)檢測中國南方地區(qū)患者致敏情況，并與ImmunoCAP系統(tǒng)進行比較，對推動我國過敏原檢測技術的發(fā)展具有重要意義，但該研究也存在不足之處，由于某些過敏原標本的高陽性級別 (>5級)在臨床上難以獲取，使得樣本以低陽性為主。

4 結 論

綜上所述，ALFA作為一種快速方便的篩查型檢測方法，由于無須昂貴的檢測儀器,小巧便捷，易于建立，價廉可靠,非常適合在社區(qū)醫(yī)院、鄉(xiāng)村醫(yī)院等醫(yī)療條件不足的地區(qū)推廣，使過敏原診斷在落后區(qū)域得以應用，讓這些地區(qū)的患者能及時了解自身過敏情況，做到早診斷早預防，避免發(fā)展為更嚴重的慢性疾病如哮喘等。