膽石病患者膽汁酸代謝輪廓分析1

段銀環(huán)，畢小云△，邵 勇，李 歡

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.產(chǎn)科，重慶 400046)

膽石病是臨床最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病之一，其成石機(jī)制目前仍不十分清楚。研究表明,膽石病發(fā)病的根源是膽汁酸代謝紊亂及膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞[1]。膽汁酸代謝輪廓是反映生物體內(nèi)膽汁酸種類、水平、變化的指標(biāo)。當(dāng)肝臟發(fā)生病變或患膽管疾病時(shí)會(huì)引起膽汁酸代謝障礙，總膽汁酸早期不會(huì)發(fā)生明顯改變，而血清中各種亞型膽汁酸水平將產(chǎn)生相應(yīng)的變化，使血清中膽汁酸成分與水平顯著改變[2]。監(jiān)測(cè)人體內(nèi)膽汁酸代謝輪廓的特征有望用于肝膽疾病的早期診斷及鑒別診斷。因此，需要對(duì)膽石病患者血清中膽汁酸進(jìn)行全面分析，以充分掌握與成石有關(guān)的膽汁酸的毒性作用及發(fā)現(xiàn)具有早期診斷作用的標(biāo)志膽汁酸。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法同時(shí)檢測(cè)膽石病患者和健康志愿者(對(duì)照)血清中15種膽汁酸的水平，結(jié)合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)建立診斷區(qū)分模型，并初步探討血清膽汁酸代謝輪廓分析對(duì)膽石病的初步診斷價(jià)值及可能的成石機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 共收集2018年1月至2019年1月到重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的膽石病患者及健康志愿者共84例為研究對(duì)象，其中對(duì)照組51例，膽石病組33例。清晨采集研究對(duì)象的空腹靜脈血3 mL，待標(biāo)本凝固后離心，提取上層血清保存于-80 ℃冰箱直至上機(jī)分析。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：赴重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢健康者；平均每天攝入乙醇量<20 g；在同期的醫(yī)學(xué)檢查中，肝腎功及血脂處于正常參考區(qū)間內(nèi)；無(wú)人患有糖尿病和血脂異常等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；無(wú)被診斷為膽結(jié)石或有任何肝腎功能障礙疾病或其他血液系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)疾病。膽石病組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)B超和(或)CT、MRI及逆行胰膽管造影(ERCP)檢查確診的膽石病患者，除外各種類型肝炎及其他原因引起的肝臟損傷，不合并糖尿病、代謝綜合征及其他慢性疾病。

1.2儀器與試劑 Waters Xevo TQD IVD 串聯(lián)質(zhì)譜；Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀；Masslynx 4.1工作站(美國(guó)Waters公司)；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)；Cobas c701全自動(dòng)生化分析儀；甘氨石膽酸(GLCA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Toronto Research Chemicals公司；膽酸(CA)、石膽酸(LCA)、脫氧膽酸(DCA)、熊脫氧膽酸(UDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、牛磺膽酸(TCA)、甘氨膽酸(GCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、牛磺脫氧膽酸(TDCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)標(biāo)準(zhǔn)品及同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)氘代膽酸(d4-CA)、氘代脫氧膽酸(d4-DCA)、氘代熊甘氨膽酸(d5-GCA)、氘代熊脫氧膽酸(d4-UDCA)、氘代石膽酸(d4-LCA)均購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.3方法

1.3.1血清標(biāo)本前處理 在0.25 mL血清標(biāo)本中,加入1 mg/mL 內(nèi)標(biāo)(3，12-二醇-7-一醇-5β-膽酸)甲醇液10 μL,加入甲醇4 mL，超聲震動(dòng)20 min，4 000 g離心20 min，上清液在60 ℃用氮?dú)獯蹈伞Ｏ纫来胃饔? mL的氯仿-甲醇(2∶1 V/V)、甲醇和水活化C18小柱。吹干的血清溶于1 mL水中,上樣。依次用2 mL水、2 mL正己烷沖洗,最后用5 mL甲醇洗脫。在60 ℃用氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔锶苡? mL乙腈-水(1∶1)中。

1.3.2色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液(體積比)，B相為0.1%甲酸-乙腈：甲醇(3∶1,v∶v)溶液； 流速：0.4 mL/min；柱溫：45 ℃；梯度洗脫程序：0～2.0 min,>35%～43%,B;>2.0～3.5 min,>43%～46%,B;>3.5～5.0 min,>46%～<59%,B;>5.0～7.0 min,59%,B;>7.0～8.7 min,>59%～66%,B;>8.7～10.7 min,>66%～98%,B;>10.7～11.3 min,35%,B。離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速:800 L/h；錐孔氣流速:50 L/h。用時(shí)間分段來(lái)提高待測(cè)物響應(yīng)值，15種膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3.3方法學(xué)評(píng)價(jià)及質(zhì)控 15種膽汁酸在1.0～6 000.0 nmol/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性決定系數(shù)(R2)均>0.993；目標(biāo)物的定量限為1.0～10.0 nmol/L；低、中、高水平的萃取回收率在95.5%～114.1%，日內(nèi)、日間精密度(RSD)均<11.4%，15種膽汁酸的高低質(zhì)控變異系數(shù)<15%。

表1 15種膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4特征標(biāo)志膽汁酸的篩選 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 13.0 (Umetrics 瑞典)軟件，結(jié)合PCA和OPLS-DA對(duì)血清膽汁酸譜進(jìn)行分析，建立模式識(shí)別模型。再根據(jù)所得的投影重要性值(VIP)及其置信區(qū)間對(duì)標(biāo)志物進(jìn)行初步篩選，獲得對(duì)分組有貢獻(xiàn)的膽汁酸變量。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：VIP>1且置信區(qū)間不包括0的膽汁酸。對(duì)初篩的標(biāo)志物進(jìn)行不同組間的非參數(shù)檢驗(yàn)以尋找有差異的特征標(biāo)志膽汁酸。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料 對(duì)照組與膽石病組相比，性別構(gòu)成(χ2=1.706,P=0.191)、直接膽紅素(DBil)(t=-2.020，P=0.052)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可排除性別對(duì)膽汁酸譜的影響。2組年齡、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBil)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組與膽石病組一般資料比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05。

2.2構(gòu)建區(qū)分模型 將得到的膽汁酸數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA13.0軟件先進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的PCA分析，根據(jù)DModX及Loading plot對(duì)異常離群點(diǎn)(outlier)反復(fù)剔除后建立PCA模型，模型解釋力(R2X=83.9%)，預(yù)測(cè)力(Q2=43.9%)，見(jiàn)圖1。依據(jù)篩除后的數(shù)據(jù)構(gòu)建有監(jiān)督的OPLS-DA模型，見(jiàn)圖2。交叉驗(yàn)證顯示預(yù)測(cè)能力Q2=20.8%，50.9%的變量[R2(X)]可用于解釋26.3%的組間差異[R2(X)]。從3D得分圖中可以看出對(duì)照組分布在右側(cè)，膽石病患者分布在左側(cè)，該模型篩選到的標(biāo)志膽汁酸有GCDCA、CDCA、GUDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA。

注：N代表對(duì)照組，S代表膽石病組。A代表二維得分圖，B代表3D得分圖。

圖1基于對(duì)照與膽石病組的PCA模型

注：N代表對(duì)照組，S代表膽石病組。A代表二維得分圖，B代表3D得分圖。

圖2基于對(duì)照與膽石病組的OPLS-DA模型

表3 健康對(duì)照與膽石病膽汁酸代謝輪廓[nmol/L,M(P25,P75)]

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05,bP<0.01。

2.3特征膽汁酸臨床價(jià)值評(píng)估 為探索這些標(biāo)志膽汁酸對(duì)膽石病的診斷效能，將膽石病與對(duì)照組進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，尋找有差異的標(biāo)志膽汁酸。見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，膽石病組的GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TCDCA、TCA差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)差異膽汁酸進(jìn)行ROC曲線分析并計(jì)算他們的AUC，膽石病組TLCA的AUC為0.615(P<0.05)，認(rèn)為有較好的區(qū)分效能,表4、見(jiàn)圖3。

表4 膽石病差異膽汁酸的AUC及P值

圖3 膽石病差異膽汁酸的ROC曲線及AUC

3 討 論

PCA是將多個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維化為少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)的一種方法,它在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上將樣本指標(biāo)數(shù)壓縮,使數(shù)據(jù)矩陣簡(jiǎn)化,降低維數(shù),PCA是通過(guò)分析可觀測(cè)的指標(biāo),提取幾個(gè)較少的綜合指標(biāo)以揭示原來(lái)變量絕大多數(shù)信息的一種多元統(tǒng)計(jì)方法[3-5]。OPLS-DA是將正交信號(hào)校正方法(OSC)與偏最小二乘法(PLS)相互結(jié)合同時(shí)對(duì)偏最小二乘法進(jìn)行改進(jìn)。OPLS-DA可以更好地區(qū)分組間差異,提高模型的有效性和解析能力。目前，OPLS-DA在代謝組學(xué)研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其應(yīng)用價(jià)值也不斷被認(rèn)可[6-7]。

膽石病是多因素作用的結(jié)果，研究表明膽石病發(fā)病的根源是膽汁酸代謝紊亂及膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時(shí)檢測(cè)膽石病患者和健康志愿者血清中15種膽汁酸的水平并分析膽汁酸亞組份的差異，建立區(qū)分模型，探討可能的成石機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，膽石病組的GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可以作為膽石病的標(biāo)志膽汁酸，其中TLCA有一定的區(qū)分效能。

既往有研究表明，游離型膽汁酸的差異主要影響膽石病的形成[8]，這與本研究結(jié)果不符，本研究中，有差異的除CDCA是游離型膽汁酸外，GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA均為結(jié)合型膽汁酸，膽汁酸的毒性通常與其兩親性有關(guān)，大量毒性膽汁酸的堆積可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激及凋亡，最終導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)損傷。有研究表明，DCA、LCA是毒性最大的疏水膽汁酸[9-11]，在本研究中未見(jiàn)明顯升高。事實(shí)上，牛磺結(jié)合膽汁酸和甘氨結(jié)合型膽汁酸都是疏水性膽汁酸，具有相似的細(xì)胞毒性作用[10,12-14]。本研究中膽石病組GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA，與對(duì)照相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是成石的主要因素，同時(shí)也可以解釋膽石病患者的肝功能損害。

LCA是CDCA在腸道細(xì)菌的作用下脫羥基形成的一種次級(jí)膽汁酸，既往有研究表明，LCA在無(wú)癥狀的膽石病患者血清中可測(cè)出，而在健康人血清中檢測(cè)不出，認(rèn)為L(zhǎng)CA可以用來(lái)鑒別膽石病的有無(wú)[15]，但也有學(xué)者在健康人血清標(biāo)本中檢測(cè)出LCA[16]。在本研究中，LCA與對(duì)照比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CDCA及TLCA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合本研究結(jié)果，認(rèn)為可以將血清TLCA作為區(qū)分膽石病與非膽石病的指標(biāo)。

既往研究表明，血清DCA水平增多是結(jié)石形成的誘發(fā)因素之一[17]，本實(shí)驗(yàn)中膽石病組血清樣本中DCA水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，DCA在膽固醇結(jié)石形成中的作用存在爭(zhēng)議，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究中結(jié)合膽汁酸GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA的差異主要影響膽石的形成；TLCA可能是鑒別膽石病與非膽石病的指標(biāo)，膽汁酸代謝輪廓對(duì)臨床診斷膽石病有較大的應(yīng)用價(jià)值，有望用于膽石病的早期診斷及鑒別診斷。