獸用生物制品中支原體的污染來源及檢測(cè)預(yù)防控制措施

張秀華，路偉，和彥良，李淑芬，胡尚競(jìng)，趙倩雯，葉雙九，蘇瑋瑋

(華威特(江蘇)生物制藥有限公司，江蘇泰州 225300)

獸用生物制品是用微生物、微生物代謝產(chǎn)物、原蟲、動(dòng)物血液或組織等經(jīng)加工制成，作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他有關(guān)疾病的免疫制劑。獸用生物制品的生物安全直接或間接地影響著人類的健康和安全，關(guān)注和重視獸用生物制品的質(zhì)量，既能保障動(dòng)物健康，更能保障全人類的健康，維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定。1898年，Nocard和Reux首次從患傳染性胸膜肺炎病牛中分離出支原體。牛支原體可感染各年齡段的牛，可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、角膜炎、乳腺炎及關(guān)節(jié)炎等疾病[1]。宿主對(duì)牛支原體的清除通常無效，并有可能參與到發(fā)病機(jī)制中。隨著診斷技術(shù)的提高，人們對(duì)支原體的認(rèn)識(shí)不斷深入。目前，自然界中支原體近100余種，可直接或間接引起人類或動(dòng)物的呼吸道感染、生長(zhǎng)發(fā)育停滯及免疫系統(tǒng)損傷。支原體引起了醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注[2]。

支原體是自然界中存在的最小、最簡(jiǎn)單的原核生物，大小介于細(xì)菌和病毒之間，可通過濾菌器，對(duì)許多抗生素有抗性，是細(xì)胞培養(yǎng)中一種常見的污染微生物。支原體可通過頂部的細(xì)胞器特異性和宿主細(xì)胞結(jié)合。這些頂部的細(xì)胞器含有高濃度的粘附蛋白，可粘附到真核細(xì)胞并穿入到細(xì)胞內(nèi)部。支原體缺乏細(xì)胞壁，它們的胞膜可和宿主的細(xì)胞膜融合，且可交換其胞膜和胞漿成分。支原體污染在生物制品生產(chǎn)過程中依然是棘手的問題，近年來，特別是2006年我國(guó)全面強(qiáng)制實(shí)施獸藥GMP以來，我國(guó)的生物制品行業(yè)取得了令人矚目的成就，行業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)環(huán)境逐步規(guī)范，獸用生物制品的種類、數(shù)量不斷增加，質(zhì)量得到不斷提升，產(chǎn)銷量出現(xiàn)了前所未有的良好勢(shì)頭，為我國(guó)動(dòng)物疫病防控，特別是重大動(dòng)物疫病防控起到了關(guān)鍵作用[3]。但隨著行業(yè)的不斷發(fā)展，污染的問題依然存在，傳統(tǒng)組織活疫苗和細(xì)胞毒活疫苗易受支原體污染，一旦污染則損失巨大[5]。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢測(cè)我國(guó)禽用活疫苗支原體污染率達(dá)70%以上。劉軼秋等匯總了2007-2011年間26家企業(yè)生產(chǎn)的22個(gè)品種141批制品的支原體檢驗(yàn)情況，抽檢的141批生物制品中支原體檢驗(yàn)項(xiàng)合格批數(shù)為113批，不合格28批，合格率為80.1%[5]。吳華偉等統(tǒng)計(jì)了2008-2017年各類豬用病毒類生物制品不合格批次中，支原體檢驗(yàn)不合格占比達(dá)19.8%，并建議應(yīng)增加支原體的其它檢驗(yàn)方法進(jìn)行補(bǔ)充和完善，方能保證我國(guó)獸用生物制品的支原體檢驗(yàn)的檢出率和準(zhǔn)確性[6]。英聰?shù)仍趯?duì)市場(chǎng)上的獸用疫苗隨機(jī)抽檢中，檢測(cè)出豬肺炎支原體、雞毒支原體、滑液支原體和絮狀支原體[7]，證明了我國(guó)獸用生物制品的支原體污染現(xiàn)象比較普遍。

1 獸用生物制品污染支原體的主要來源

1.1 細(xì)胞和種毒污染支原體 種毒在疫苗生產(chǎn)中的作用至關(guān)重要，在某種程度上它是疫苗內(nèi)在質(zhì)量和屬性特點(diǎn)的決定因素，若種毒污染了支原體，通過逐級(jí)培養(yǎng)放大，必然會(huì)影響疫苗的質(zhì)量。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體污染發(fā)生率達(dá)63%，因此，細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染仍是一個(gè)世界性的難題。污染細(xì)胞的支原體主要有人源、豬源和牛源三類，還有發(fā)酵支原體、豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、梨支原體、唾液支原體、萊氏無膽甾支原體和人型支原體[8]。實(shí)驗(yàn)室的工作人員是口腔支原體、發(fā)酵支原體和人型支原體的主要來源。精氨酸支原體和無膽甾原體主要來自胎牛血清和新生牛血清[9]。

1.2 血清和胰酶污染支原體 血清作為疫苗生產(chǎn)中的主要原輔材料，極易被支原體污染。支原體是牛血清中常見的微生物之一，不能用除菌過濾膜除去[10]。現(xiàn)行版《中國(guó)獸藥典》中生物制品生產(chǎn)和檢驗(yàn)用牛血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定必須檢驗(yàn)支原體，目的是保證牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞及其制品無支原體污染。李明生等利用直接培養(yǎng)法、DNA熒光染色法和PCR法對(duì)17批新生牛血清樣品進(jìn)行了支原體檢測(cè)，結(jié)果表明，應(yīng)將直接培養(yǎng)法和DNA熒光染色法或PCR法同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用，以提高血清中支原體檢測(cè)的準(zhǔn)確性。胰酶是疫苗生產(chǎn)過程中細(xì)胞傳代、消化所需關(guān)鍵物料，取自羊、豬、牛等動(dòng)物的胰腺，極易污染支原體。

1.3 雞胚污染支原體 SPF雞和雞胚是禽用生物制品生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)節(jié)的主要原材料，直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量和檢驗(yàn)結(jié)果。國(guó)標(biāo)《GB/T 17999.1-2008 SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第一部分：SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)總則》中關(guān)于SPF雞需監(jiān)測(cè)19個(gè)項(xiàng)目，其中第4項(xiàng)和第5項(xiàng)要求檢測(cè)雞毒支原體和滑液囊支原體[11]。

1.4 原代細(xì)胞或動(dòng)物組織污染支原體 生產(chǎn)豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)的細(xì)胞為牛睪丸原代細(xì)胞或羊睪丸原代細(xì)胞，牛或羊動(dòng)物本身易感染支原體，且被毛較多，消毒不徹底易污染支原體。另外，豬瘟活疫苗(兔源)的生產(chǎn)需使用兔脾臟或淋巴結(jié)等組織，同樣增加了支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。所以，利用動(dòng)物組織生產(chǎn)獸用生物制品，污染支原體的風(fēng)險(xiǎn)極高，對(duì)接種動(dòng)物存在較大的威脅。獸用生物制品的生產(chǎn)工藝快速提升，已從原來的原代細(xì)胞或動(dòng)物組織工藝發(fā)展到傳代細(xì)胞系培養(yǎng)，正向懸浮培養(yǎng)工藝發(fā)展，大大降低了各種污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。

1.5 環(huán)境污染支原體 McGarrity通過一個(gè)模型發(fā)現(xiàn)了支原體在超凈臺(tái)內(nèi)的細(xì)胞傳代過程中的傳播速度，活的支原體在超凈臺(tái)表面至少可存活4～6 d，且可成功復(fù)壯。傳完被支原體污染的細(xì)胞后，再傳干凈的細(xì)胞，在6周后仍可檢測(cè)出支原體陽性，表明支原體的傳播容易和快速。

2 常用的支原體檢測(cè)方法

2.1 一步法試劑盒檢測(cè)法 目前，多家公司推出Mycoplasma test kit(one step quick color)，一步法試劑盒的原理是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，操作簡(jiǎn)單，加樣量?jī)H1 μL，通過變色來判定結(jié)果。曹元元等將實(shí)驗(yàn)室保存的牛支原體(M.bovis)分離株復(fù)蘇培養(yǎng)物用培養(yǎng)法、PCR檢測(cè)法和一步法三種方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果三種方法都可以鑒定培養(yǎng)物中支原體的存在；與培養(yǎng)法相比，一步法結(jié)果用肉眼就能清晰可見，周期短；與PCR檢測(cè)法相比，一步法操作簡(jiǎn)單，周期短，但一步法的特異性較差，不能區(qū)分不同種屬的支原體，因此應(yīng)采用PCR與一步法相結(jié)合的方法以提高支原體檢測(cè)的準(zhǔn)確性[12]。

2.2 PCR法 PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、產(chǎn)率高、可有效縮短檢測(cè)時(shí)間、更加便捷、重復(fù)性好、易自動(dòng)化、對(duì)標(biāo)本的純度要求低等突出優(yōu)點(diǎn)。但是，PCR還有易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果、結(jié)果不具有肯定性、需多次摸索條件、要求操作熟練等缺點(diǎn)。秦明明等針對(duì)16S rRNA設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，經(jīng)大量試驗(yàn)摸索篩選出了一種可靠快速的實(shí)驗(yàn)室支原體PCR檢測(cè)方法，序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGGCAGGA-3’,5’-TGCACCATCTGTC￣ACTCTGTTAACCTC-3’，目的片段為1021 bp，該P(yáng)CR最低能夠檢出10 pg牛支原體基因組DNA以及濃度為100 CCU/mL的牛支原體培養(yǎng)物[13]。高廣仁等建立了獸用生物制品中支原體污染的PCR檢測(cè)方法，引物序列為：5’-GGGCCA￣AGAGGTTGTA-3’，5’-CCTTCGCCTATTGGTG-3’，目的片段約440 bp，該方法對(duì)大腸桿菌、沙門氏桿菌、巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、新城疫病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；對(duì)雞毒支原體、豬肺炎支原體、禽滑液支原體基因組DNA的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到0.13 ng、0.88 ng、0.14 ng，與培養(yǎng)法的符合率達(dá)98.84%。以上結(jié)果表明，PCR方法適用于獸用生物制品生產(chǎn)的質(zhì)量控制和疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)的補(bǔ)充方法[14]。

2.3 分離培養(yǎng)法 分離培養(yǎng)法使用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，大多數(shù)支原體可在固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)特有的典型菌落，或在液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)pH值變化，該方法準(zhǔn)確、可靠，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，敏感性不夠高，易受抗生素影響，且不能檢出所有的支原體。目前，在《中國(guó)獸藥典》中仍以培養(yǎng)法作為支原體的基本檢測(cè)方法，但獸用生物制品企業(yè)亟待增加新的快速檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充和完善。卞曉翠等發(fā)現(xiàn)PCR法和培養(yǎng)法檢測(cè)支原體具有較好的互補(bǔ)性，應(yīng)聯(lián)合使用進(jìn)行定期檢測(cè)，以提高支原體的檢出率[15]。

2.4 DNA結(jié)合熒光素染色 支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭氏染色陰性。DNA結(jié)合熒光素染色法是利用熒光染料(bisben￣zimide, Hoechst 33258)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域(A-T含量達(dá)55%～80%)染色來實(shí)現(xiàn)支原體的檢測(cè)。經(jīng)染色后被支原體感染的細(xì)胞周圍出現(xiàn)許多大小均一的熒光小點(diǎn)，證明有支原體存在。DNA熒光染色法適用于細(xì)胞和血清中的支原體檢驗(yàn)，檢驗(yàn)時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)單，能對(duì)支原體污染的程度進(jìn)行定量觀察，但對(duì)儀器設(shè)備要求較高，僅適合于實(shí)驗(yàn)室研究[16]。

2.5 ELISA法 某公司利用"ELISA抗體夾心法"的基本原理研制了支原體檢測(cè)試劑盒，現(xiàn)已上市銷售使用。該試劑盒具有結(jié)果準(zhǔn)確、有效避免假陽性和假陰性、省時(shí)省力更經(jīng)濟(jì)、方法簡(jiǎn)單易操作、檢測(cè)時(shí)間僅4～5 h、價(jià)格低廉、高靈敏度、高通量等特點(diǎn)。先將樣品16S ribosomal RNA (rRNA)標(biāo)上生物素標(biāo)簽和地高辛標(biāo)簽，再用預(yù)先包被在孔板上的鏈親和素進(jìn)行捕獲，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛檢測(cè)抗體，最后加入底物顯色，通過比色法得出結(jié)果來判定有無支原體。

3 預(yù)防控制支原體的污染

3.1 原材料控制 雞胚、細(xì)胞、胰酶、血清等動(dòng)物源性原材料均是獸用生物制品的重要生產(chǎn)材料，也是支原體賴以生存的基質(zhì)，有研究表明有20多種支原體易污染雞胚、細(xì)胞或血清，因此，在保證無菌的同時(shí)，使用前加強(qiáng)檢驗(yàn)可有效阻止支原體污染。另外，在細(xì)胞培養(yǎng)方面，良好的個(gè)人衛(wèi)生及操作規(guī)范是避免支原體污染的前提，再從制度上建立完善的檢驗(yàn)體系，從種細(xì)胞或原代細(xì)胞到每個(gè)代次的細(xì)胞都進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗(yàn)，保證所有代次的細(xì)胞均無支原體污染[17]。最后，對(duì)于新引進(jìn)的種毒或種細(xì)胞必須先隔離培養(yǎng)，經(jīng)檢驗(yàn)合格后方可引進(jìn)生產(chǎn)車間。

3.2 環(huán)境控制 生產(chǎn)車間應(yīng)定期清潔和消毒，并定期檢測(cè)，保證環(huán)境參數(shù)均在可控范圍內(nèi)。生產(chǎn)流程中各個(gè)環(huán)節(jié)的細(xì)化，注重人、物、產(chǎn)品以及污物的進(jìn)出路徑，避免交叉污染。生產(chǎn)設(shè)備的消毒要徹底，根據(jù)生產(chǎn)用具和器械的特性進(jìn)行相應(yīng)的高壓滅菌或消毒水浸泡，以確保消毒徹底。進(jìn)入車間潔凈區(qū)的所有物品均應(yīng)經(jīng)表面消毒或紫外照射后方可進(jìn)入。

3.3 人員管理 加強(qiáng)對(duì)所有人員的生產(chǎn)流程和操作流程的培訓(xùn)，要求所有人員嚴(yán)格按規(guī)定更衣，保證無裸露的皮膚暴露在環(huán)境中，對(duì)于有呼吸道疾病或皮膚病的人員禁止進(jìn)入車間潔凈區(qū)內(nèi)。同時(shí)，要求所有人員的操作必須規(guī)范，杜絕任何小的不規(guī)范操作細(xì)節(jié)。例如操作過程中手離開操作臺(tái)、進(jìn)入操作臺(tái)的器械或器皿未進(jìn)行消毒、用手擦汗或接觸到裸露的皮膚等均可能導(dǎo)致支原體污染。

3.4 消毒滅菌環(huán)節(jié) 通過消毒滅菌可防止各種污染物和微生物的滋生，一方面要對(duì)生物制品生產(chǎn)過程中所用到的各種器具和物品進(jìn)行消毒滅菌，通過無菌測(cè)試后方可使用，從源頭上控制污染物的出現(xiàn)。另一方面，需注意消毒滅菌方式是否有效。比如高壓鍋或干熱烤箱中堆積過多的物品造成加熱不均，導(dǎo)致的未徹底滅菌。或者滅菌循環(huán)時(shí)間過短，特別是超過500 mL的液體，或者包含固體成分的溶液，或膠體物質(zhì)(如瓊脂、淀粉)等。所以，在消毒滅菌前必須考慮滅菌材料的尺寸、質(zhì)量、性質(zhì)和體積，方可保證消毒滅菌的效果。

3.5 合理利用抗生素 抗生素對(duì)支原體污染具有一定的抑制作用，所以在生物制品生產(chǎn)過程中應(yīng)合理利用以預(yù)防支原體污染現(xiàn)象的發(fā)生。但是支原體對(duì)一般抗生素不敏感，并具有一定的抗藥性，所以應(yīng)選擇有效的抗生素，在控制好使用劑量的前提下，盡量做到既不不影響細(xì)胞的正常功能，又能較好地控制支原體污染。

4 支原體去除方法

4.1 配套試劑法 目前，有多家公司宣稱有配套的去除支原體試劑，均有以下特點(diǎn)：①毒性低：對(duì)細(xì)胞毒性小，不影響后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；②穩(wěn)定性強(qiáng)：-20 ℃能較長(zhǎng)時(shí)間保存，并保持高效用；③操作簡(jiǎn)單：只需將試劑加至支原體污染的培養(yǎng)基中孵育即可；④起效快：最快3 d即可見效；⑤去除范圍廣：能去除實(shí)驗(yàn)室存在的多種支原體。但配套試劑法的具體效果還需驗(yàn)證。

4.2 抗生素法 張丹丹等運(yùn)用抗生素(plasmocin)進(jìn)行了細(xì)胞支原體污染控制的研究，成功建立了山羊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染的預(yù)防和去除平臺(tái)[18]。較常用的抗生素有恩諾沙星、四環(huán)素、新霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、巴龍霉素等，如果長(zhǎng)時(shí)間使用同一抗生素易產(chǎn)生耐藥性。若污染了人支原體時(shí)，那么加入卡那霉素(1000 mg/mL)完全可以清除。一般對(duì)卡那霉素和四環(huán)素有抗藥性的菌株，對(duì)慶大霉素和巴龍霉素抗藥性也較大。除了以上抗生素，常推薦使用的還有泰霉素和諾霉素的復(fù)合物、喹諾酮的衍生物、Ciprobey(成分為環(huán)丙沙星)。多數(shù)學(xué)者建議聯(lián)合使用幾種抗菌素可以達(dá)到去除支原體的效果。

5 結(jié) 語

支原體是對(duì)人和動(dòng)物都有致病性的一類重要病原微生物。生物制品一旦被支原體污染，品質(zhì)會(huì)明顯下降。由于支原體污染具有隱蔽性，所以加強(qiáng)環(huán)境控制和原輔材料的檢驗(yàn)控制，是保證制品質(zhì)量的前提和基礎(chǔ)[19]。

獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)使用快捷有效的支原體檢測(cè)方法進(jìn)行早期篩查以避免造成質(zhì)量事故和不必要的損失。隨著GMP新版標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，企業(yè)應(yīng)制定更加嚴(yán)格的質(zhì)量管理制度和質(zhì)量控制制度、細(xì)化每個(gè)環(huán)節(jié)的操作規(guī)范、及時(shí)把潛在的污染因素排除，獸用生物制品的質(zhì)量一定會(huì)得到很好的保證。