從外泌體探討“腎主骨生髓”理論與骨質疏松癥的關系

郭瀾 李莉 葛繼榮

1.福建中醫藥大學，福建 福州 350003 2.福建省中醫藥科學院，福建 福州 350003

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨量降低和骨組織微結構改變，以致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨骼疾病[1]。早期調查顯示[2]，在我國50歲以上人群中，女性骨質疏松癥發病率達20.7%，男性達14.4%。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，骨質疏松癥的發病率也呈逐年上升趨勢。原發性骨質疏松癥屬于中醫的“骨痿”“骨枯”等范疇，基本病機為腎虛精虧[3]。腎之精氣對骨骼的生長發育起到了至關重要的作用，用腎主骨生髓、腎藏精等理論指導中醫藥對骨質疏松癥的防治，起到了較好的臨床療效。通過現代分子生物學研究，“腎主骨生髓”理論得到了部分的科學證實，但對其內涵的理解有待更進一步的研究。外泌體是一類大小在30～120 nm，含有核酸、脂質以及蛋白質等物質的膜封閉的細胞外囊泡[4]。外泌體被其他細胞攝取后，可以實現不同細胞間的物質交流和通訊，并且能通過影響受體細胞的信號通路，來改變周圍的微環境[5-6]。近年來研究發現，外泌體可以調節骨代謝，與骨質疏松癥有著密切的關系。本文旨在通過外泌體在骨代謝中的作用特點，探討“腎主骨生髓”理論與骨質疏松癥的關系，以此豐富“腎主骨生髓”理論的內涵，也為其指導OP的防治提供新的研究思路。

1 “腎主骨生髓”理論與OP的關系

1.1 現代對“腎主骨生髓”理論的認識

“腎主骨生髓”理論最早見于《黃帝內經》，其中《素問·陰陽應象大論》曰：“腎生骨髓”；《素問·痿論》曰:“腎主身之骨髓”。腎精封藏于腎中，可以化生骨髓以滋養骨骼，并且促進骨骼生長發育。若腎精虧虛，骨髓生化無源，便會導致骨骼失養，出現骨軟無力，骨質脆弱，臨床可見全身疼痛，易于骨折等OP的表現。因此，腎主骨生髓理論是中醫對OP最基礎及最具有概括性的認識。中醫所講之腎，具有藏精，促進人體生長發育、生殖和臟腑氣化等生理機能，并不僅僅是西醫解剖中指的腎臟。現代研究中，主要是通過腎臟對鈣磷代謝的調節、腎臟分泌的1-α羥化酶的活性，以及影響下丘腦-垂體-靶腺軸的各種調節因子來理解“腎主骨生髓”理論[7]，這些調節因子被認為是“腎主骨生髓”理論的物質基礎。

其中1,25-(OH)2D3是一種類固醇激素,可調節鈣磷的代謝, 促進骨基質中有機質的形成[8]；促紅細胞生成素(EPO) 主要是促進原始紅細胞的生成, 促進骨髓內質網紅細胞的釋放,還可在體外誘導骨髓間充質干細胞(bone- marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化[9]；骨形態發生蛋白 7(BMP-7)[10-11]可增強BMSCs的成骨分化能力,并且可以與胰島素樣生長因子(insulin like growth factor,IGF)、甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)等一同促進骨骼的重塑。通過對這些調節因子的研究，從現代分子生物學角度對“腎主骨生髓”理論有了進一步的證實，使運用補腎法防治骨相關疾病更具科學性。但是，這些調節因子大多是腎臟自身所分泌的，用于理解“腎主骨生髓”理論太過于局限，并不能很好地體現中醫的整體觀念。

1.2 “腎主骨生髓”理論與BMSCs

BMSCs屬于多功能細胞，在維持骨量中起著重要作用。BMSCs通過誘導可分化為骨細胞、軟骨細胞，脂肪細胞等，可促進骨骼形成，但其成骨分化的能力，會隨著年齡的增加而減弱[12]，這與腎精的特點是一致的。目前，在對運用補腎藥物防治骨質疏松癥的作用機制研究中，促進誘導BMSCs的成骨分化，是眾多作用機制之一。王和鳴等[13]用中藥巴戟天的醇提物及水提物制備含藥血清，加入到用經典成骨誘導方法所培養的BMSCs培養基中,發現補陽藥巴戟天能夠促進 BMSCs的成骨分化。陳云剛等[14]通過研究發現，補腎藥骨碎補的含藥血清可以通過激活wnt/β-catenin細胞通路，來促進BMSCs的成骨分化。高璐等[15]將補腎藥淫羊藿、補骨脂、何首烏等的有效成分提取物制備含藥血清，培養大鼠BMSCs后發現細胞增值率與成骨分化能力都得到提高，其機制與補腎藥能夠上調RUNX2、OSX的基因表達有關。張玉卓等[16]分別將滋陰補腎代表方左歸丸、溫腎補陽代表方右歸丸的含藥血清干預大鼠BMSCs，結果發現左歸丸、右歸丸均能一定程度地促進BMSCs的成骨分化。這些研究表明，補腎中藥、溫腎陽及養腎陰類方劑可以促進BMSCs向成骨細胞分化，從而調節骨代謝、增加骨量以治療骨質疏松癥。在中醫“腎主骨生髓”的理論中，腎精的作用尤為關鍵。腎精一部分化為生殖之精，維持機體正常的生長發育與生殖機能，另一部分則化髓充養骨齒。BMSCs的功能與腎精的作用存在類似之處，可通過BMSCs的成骨分化來進一步理解腎主骨生髓理論的內涵。

2 外泌體與OP的關系

2.1 外泌體的研究現狀

外泌體是細胞分泌的具有穩定雙層膜結構的具膜小體，尺寸在 30～120 nm之間，可以選擇性地包裹大量生物活性物質，如蛋白質、脂質和核酸等[17]。外泌體首次于1987年在綿羊的網織紅細胞中發現[18]，之后在樹突狀細胞[19]、T細胞[20]、B細胞[21]等中都相繼有發現。在進入細胞外微環境后，外泌體可通過膜融合的方式，將包裹的物質傳遞到受體細胞中，進行物質的交流和傳遞，是細胞間通訊的重要介質[22]。有研究表明[23-24]，骨重塑受到包裹在外泌體中關鍵因子的調節。越來越多的證據表明[24]，由外泌體介導的破骨細胞和成骨細胞之間平衡的雙向信號傳遞，克服了病理性破壞性骨疾病導致的骨丟失。因此，用外泌體防治骨質疏松癥具有很大的研究前景。

2.2 外泌體各成分對OP的影響

外泌體內含蛋白質、DNA、mRNA、microRNA等多種成分[25]。Xu等[26]首次報道了在BMSCs成骨分化過程中分泌的外泌體中含有miRNA，他們發現與其他來源的外泌體相比，其中miR-199B、miR-218、miR-148 A、miR-135B、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302B顯著上調。其中microRNA hsa-miR-135B可促進BMSCs的成骨分化；miR-218以及Wnt信號通路，可以通過信號放大的方式促進人脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的成骨分化[27]。既往研究已證實，外泌體中的miR-214廣泛參與骨形成及吸收過程[28-29]，miR-133 可參與調節BMSCs的成骨分化過程[30]。Lu等[31]報道，ADSCs來源的外泌體中包含了Wnt-3a蛋白，能夠增強人類初代成骨細胞的增殖能力和成骨分化能力，其中的 Wnt蛋白被報道與骨再生和骨環境的穩態具有十分密切的關系[32]。并且，Li等[33]將AdSCs來源的外泌體植入小鼠顱骨缺損模型中，在顯微 CT下觀察到了成骨的效果。

2.3 外泌體對BMSCs的影響

眾多研究表明，外泌體對骨代謝的影響主要是通過調節BMSCs的成骨分化。Cui等[34]提取成骨細胞分泌的外泌體，并與BMSCs共同培養，結果發現BMSCs表面RUNX2基因的表達以及堿性磷酸酶都顯著上調，這說明成骨細胞來源的外泌體能增強BMSCs成骨分化能力。人單核細胞分泌的外泌體對BMSCs也具有促成骨分化作用，該類外泌體與BMSCs共培養后，其細胞表面的成骨標志基因RUNX2、骨形態發生蛋白-2的表達與對照組相比顯著增加[35]。人樹突狀細胞來源的外泌體對BMSCs的成骨分化亦有顯著促進作用，經其作用后的 BMSCs堿性磷酸酶的活性增強，成骨分化特異性轉錄調節因子RUNX2表達增加[36]。

2.4 干細胞來源的外泌體對OP的影響

非干細胞來源的外泌體，可以促進BMSCs的成骨分化，而研究表明干細胞來源的外泌體也能夠影響骨代謝。研究[37-38]發現，移植的外源性BMSCs分泌的外泌體可以通過調控宿主BMSCs的成骨分化功能，逆轉骨質疏松，近期研究[39]發現，移植外源性細胞通過分泌外泌體影響宿主細胞的功能。宋子珺等[40]發現小鼠ADSCs分泌的外泌體，可以減少處于低氧缺血環境下的骨細胞凋亡，這表明ADSCs分泌的外泌體可以加快骨組織修復與再生。ADSCs來源的外泌體(ADSC-Exos)在成骨誘導的環境下能在體內及體外促進BMSCs向成骨細胞分化[41]。朱夢茹等[42]報道，不同分化階段分泌的ADSC-Exos形態特征略有不同，ADSC- Exos能夠被原始ADSCs高效攝取進入細胞內發揮作用，成骨預處理的ADSC-Exos能夠于體外獨立誘導原始ADSCs成骨分化。ADSCs-Exos能夠有效地促進人的初代成骨細胞(human primary osteoblastic cells，HOBs)增殖和分化為成骨細胞[31]，主要是通過增強Wnt-3a信號通路的表達，從而促進HOBs向成骨細胞分化，達到骨修復和再生的目的。Qi等[43]將人誘導的間充質干細胞所分泌的外泌體(hiPSC-MSC-Exos)與通過去除卵巢造模成功的OP大鼠的骨髓間充質干細胞(rBMSCs-OVX)一同培養，結果發現hiPSC-MSC-Exos 可以促進rBMSCs-OVX的增殖和成骨分化能力，并且增加外泌體的濃度，rBMSCs-OVX的成骨分化能力也相應得到提高。

3 從外泌體探討運用“腎主骨生髓”理論防治OP

用中醫“腎主骨生髓”理論指導骨相關疾病，特別是對OP的防治，在臨床上已取得較好的療效。結合現代分子生物學的研究，可以更好的理解、擴展該理論的內涵，使其更好地指導臨床。但對中醫腎的理解不能局限于西醫之腎臟，對“腎主骨生髓”理論的研究也不能局限于腎臟所分泌的物質。BMSCs的成骨分化在骨代謝中起到了非常關鍵的作用，其功能與促進機體生長、發育、生殖的“腎精”類似。腎精來源于先天之精，受后天之精的充養。腎藏精，精化氣，氣分陰陽，則為腎陰與腎陽。BMSCs與腎陽、腎陰在功能方面皆有聯系。腎陽能推動及激發臟腑各項機能，骨骼的生長發育也有賴于腎陽的推動，腎精促進機體生長發育最主要的表現在于腎氣推動骨骼的發育，概括為“腎主骨”；BMSCs能分化為成骨細胞，直至骨細胞，從而促進骨形成及維持骨的基本結構，與腎陽的部分功能相通。腎陰可以涼潤臟腑形體官竅，腎陰足則有充足的津血以濡養骨骼，精生髓，髓居于腦及骨中，居于骨為骨髓，骨髓滋養骨，才能使骨骼保持堅固有力，維持骨的正常生理功能，且腎精能化赤為血，給骨骼提供充足的營養；BMSCs來自于骨髓之中，與造血微環境相關，可促進造血干細胞的造血功能[44]。因此，腎精及“腎主骨生髓”理論與BMSCs存在密切的關聯。

現代研究中，BMSCs的功能及分化受到眾多因子的調控，其中外泌體是一大影響因子。且外泌體對OP的影響主要是通過促進BMSCs的成骨分化及調節成骨細胞和破骨細胞的動態平衡來實現的。特別是BMSCs來源的外泌體，對骨代謝的影響較為顯著。外泌體與既往研究中作為腎主骨生髓理論物質基礎的相關因子類似，可以通過細胞間的信息傳遞來調節細胞的生理機能。在“腎主骨生髓”理論指導下運用補腎藥物及方劑治療OP取得了一定的臨床療效，對其具體的作用機理也有相關研究，且主要是與BMSCs的成骨分化相關，但對于如何調控BMSCs的成骨分化方面研究不夠深入。外泌體對BMSCs的成骨分化的影響已有較為明確的研究證實，且具有影響作用的外泌體還包括非BMSCs所產生，這與“腎主骨生髓”理論中腎對機體的調控是全身性的相一致。因此，可以通過外泌體來探討“腎主骨生髓”理論與OP的關系，為運用補腎法防治OP提供新的研究思路，也使“腎主骨生髓”理論可以更好的被現代醫學所理解和認可。

4 總結與展望

通過對“腎主骨生髓”理論與OP的關聯性出發，根據外泌體在骨代謝中的生物學功能上與BMSCs關系密切并且與腎的生理功能存在一定的相關性，說明可以通過外泌體來探討“腎主骨生髓”理論防治OP的科學性。通過外泌體加深對“腎主骨生髓”理論的研究，豐富其內涵，促進中醫理論與現代研究相結合，為OP的防治提供更多的思路與指導。通過現代分子生物學研究來理解中醫理論可以使得中醫經典理論更具科學性，但終究不能完全體現中醫理論的內涵。希望在今后的研究中，會有更好的辦法可以深入挖掘中醫理論的內涵，使其得到更好的傳承和發展。