龜板調控BMSCs增殖、遷移和成骨分化及其抗骨質疏松癥的研究進展

余翔 任輝* 沈耿楊 張鵬 余富勇 尚奇 湯凱 張志達 招文華 梁德 江曉兵,3*

1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院脊柱骨科，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是易導致骨折等嚴重并發癥的一種全身性系統性骨代謝疾病，嚴重威脅患者生命健康，給家庭、社會帶來了沉重負擔[1-2]。如何有效防治OP是目前的難題。中醫藥在防治OP方面具有獨特優勢[3-4]。龜板有補腎強骨、填精益髓的功效，可通過調控骨髓間充質干細胞(BMSCs)增殖、遷移及成骨分化，促骨形成，改善OP骨損害，從而有效抗各種OP，如絕經后骨質疏松癥(PMOP)、激素性骨質疏松癥(GIOP)和老年性骨質疏松癥(SOP)。龜板通過調控骨代謝相關microRNAs、細胞信號通路及相關因子表達調控BMSCs增殖、遷移和成骨分化，從而起到抗OP作用。本文將圍繞當前文獻報道的龜板對BMSCs增殖、遷移和成骨分化的調控機制及其抗OP作用機制的相關研究進行綜述，旨在為中醫藥抗OP提供參考。

1 龜板對BMSCs增殖、遷移和成骨分化的調控作用及機制

1.1 龜板對BMSCs增殖的影響

據報道[5-7]，龜板含藥血清可上調骨形態發生蛋白-4(BMP-4)表達促大鼠BMSCs增殖，該作用呈量效和時效依賴性。陳東風等[8]證實，乙酸乙酯萃取的龜板提取物(PTE)可呈劑量和時間依賴性促BMSCs增殖，低濃度(30 μg/mL)PTE干預BMSCs 1 d時無明顯促增殖效果，干預3 d時顯著促增殖；而高濃度(300 μg/mL)PTE干預1 d時可顯著促增殖。此外，他們予低[3 mg/(kg·d)]、高濃度[30 mg/(kg·d)]PTE灌胃大鼠，發現低濃度PTE灌胃干預1 d后大鼠來源的BMSCs中CD44陽性細胞(代表細胞循環周期)無顯著升高，干預3 d后大鼠來源的BMSCs中CD44陽性細胞顯著升高；而來源于高濃度PTE灌胃1 d和3 d后大鼠來源的BMSCs中CD44陽性細胞均顯著升高。進一步研究發現，PTE促BMSCs增殖可能與BMP-4上調相關，低(30 μg/mL)、高濃度(300 μg/mL)PTE干預BMSCs 1、3、5 d后，BMP-4表達呈“先升高后降低”的趨勢(3 d時達峰值)。此外，宋述財等[9]研究表明，高(3 333 μg/mL)、中(333.3 μg/mL)、低(33.33 μg/mL)劑量PTE通過調控維生素D受體(VDR)、視黃酸受體α(RARα)促BMSCs增殖，且促增殖效果呈劑量依賴性。

有趣的是，龜板對BMSCs增殖存在雙向調控作用，即龜板對BMSCs增殖既有促進，又有抑制作用。Wang等[10-11]用乙酸乙酯萃取并通過硅膠柱層析梯度洗脫法分離龜板得到16個組分(Ts-1～16))，發現Ts-12中鑒定出的棕櫚酸甲酯(S-1)和肉豆蔻酸膽固醇(S-8)促BMSCs增殖，而Ts-4中的硬脂酸(S-5)抑制BMSCs增殖。張海玲等[12]研究發現，PTE干預BMSCs早期(36 h和3 d)劑量依賴性上調分化抑制蛋白1(Id1)表達，促BMSCs增殖；干預BMSCs晚期(7 d)時，PTE可下調Id1表達，抑制BMSCs過度增殖。張越華等[13-14]發現，龜板石油醚提取物(龜板浸膏)中同時具有促增殖和抑制增殖的物質，十六烷酸在低(0.15 μg/μL)、高濃度(1.5 μg/μL)均可顯著促大鼠BMSCs增殖；而龜板浸膏甲酯化產物中的十六烷酸甲酯在低濃度時促BMSCs增殖，但在高濃度時反而抑制BMSCs增殖。然而，以上文獻報道中，龜板對BMSCs增殖的影響僅有表型結果，關于龜板對BMSCs增殖的促進或抑制作用的具體起效過程及深層機制尚未完全明確，將來有必要對龜板雙向調控BMSCs增殖的量效關系、中間回路及平衡機制進行研究。

1.2 龜板對BMSCs遷移的影響

目前，關于龜板對BMSCs遷移影響的研究較少。黃小兵等[15]證實，龜板含藥血清可呈劑量依賴性上調HGF/c-met軸促進BMSCs遷移。筆者研究發現，龜板水提成分可上調SDF-1/CXCR4軸促BMSCs遷移(相關結果待發表)。

1.3 龜板對BMSCs成骨分化的影響

1.3.1龜板調控成骨相關因子誘導BMSCs成骨分化：BMSCs可向成骨細胞方向分化[16]。成骨相關因子堿性磷酸酶(ALP)[17]、Runt相關轉錄因子2(Runx2)[18]、骨橋蛋白(OPN)[19]、VDR[20]、RARα[21]、BMP-4[22]、Id1[23]與BMSCs成骨分化密切相關。據報道[24]，龜板可顯著提高ALP活性、促進鈣沉積促BMSCs成骨分化。此外，PTE可上調ALP、Runx2和OCN表達，促成骨分化[25, 26]。侯秋科等[25]證實，PTE上調VDR表達誘導BMSCs成骨分化，且該過程可能與VDR調節BMP通路相關[27]。此外，陳金鋒等[28]也證實VDR可能是PTE調控BMSCs成骨分化的作用靶點之一。張海玲等[12]證實，PTE干預BMSCs 7 d時，活化了BMP-4，從而下調Id1(BMP-4靶基因)表達，從而促BMSCs成骨分化。

1.3.2龜板調控miRNAs和信號通路誘導BMSCs成骨分化：miRNA已被證實在OP發病中起重要調控作用[29]。據報道[29]，PTE可能通過“中藥小分子物質-miRNA-mRNA-lncRNA”調控網絡調控BMSCs向成骨方向分化，PTE通過抑制miRNA-351，上調靶基因VDR表達，從而誘導BMSCs成骨分化。此外，PI3K/AKT[30]、p38 MAPK通路[31]對BMSCs成骨分化起重要作用。筆者證實，PTE(干預濃度為30 μg/mL)可通過調控let-7f-5p/TNFR2/PI3K/AKT軸[26]、p38 MAKP/STE20/IGF1R/TRAF6 軸[33]促BMSCs成骨分化。龜板調控BMSCs增殖、遷移和成骨分化的研究進展見圖1。

圖1 龜板調控BMSCs增殖、遷移和成骨分化的研究進展Fig.1 Research progress about PT regulating the proliferation, migration, and osteogenic differentiation of BMSCs

2 龜板抗OP的作用及機制

目前臨床治療OP的藥物主要為抑制骨吸收藥物，因使用過程中存在一些并發癥從而限制了其臨床運用。龜板長期以來被運用于骨疾病治療。據報道，龜板可有效抗PMOP、GIOP和SOP。

2.1 龜板抗PMOP

PMOP是因絕經后女性雌激素急劇下降導致的系統性骨病，尋找有效防治PMOP的藥物迫在眉睫。實驗研究中常運用去卵巢動物模擬臨床PMOP患者狀態，一些學者探討了龜板對去卵巢鼠OP的防治作用。王新雨等[34]發現醋龜甲散劑和水煎劑對OP小鼠均有治療作用，而散劑效果優于水煎劑。孫蘇亞等[35]發現，龜板水、醇提取液可顯著增加成年去勢大鼠骨鈣含量和骨生物力學強度。筆者發現，龜板水提成分可促外源性BMSCs歸巢從而減少去卵巢大鼠骨丟失，預防PMOP[36]。

2.2 龜板抗GIOP

GIOP是臨床最常見的繼發性骨質疏松癥。本團隊在國內外率先開展了龜板防治GIOP的作用及機制研究。本團隊證實[37]，龜板可有效改善GIOP大鼠脛骨、腰椎骨密度、骨強度。龜板可能通過降低骨轉換逆轉GIOP大鼠骨損害[38-39]。此外，龜板單獨使用或聯合阿倫磷酸鈉使用可通過靶向調控Runx2、骨保護素(OPG)和組織蛋白酶K(CTSK)治療大鼠GIOP[40-41]。龜板還可通過影響let-7f靶向TNFR2調控wnt/β-catenin通路而促BMSCs增殖和成骨分化抗GIOP[42]。

2.3 龜板抗SOP

SOP由增齡等綜合因素導致，嚴重威脅公共健康，挖掘中醫藥防治SOP的作用機制具有重要價值。研究[43]表明，龜板水提液可有效改善SOP小鼠骨損害，其機制可能與抑制NF-κB轉錄有關。本團隊近期發現，龜板可通過調控“let-7f-海馬-HPO軸”抗SOP(相關結果待發表)。

龜板抗PMOP、GIOP和SOP的研究進展如圖2所示。

圖2 龜板抗OP的研究進展Fig.2 Research progress on the mechanism of PT in anti-osteoporosis

3 總結及展望

綜上，龜板可調控BMSCs增殖、遷移和成骨分化，目前研究已初步證實龜板具有抗GIOP、PMOP和SOP的作用。但目前龜板對BMSCs增殖、遷移和成骨分化及抗OP的機制尚未完全明確，仍缺乏相關研究。因此，為進一步闡明龜板抗OP的作用機制，可從以下幾個方面開展研究：① 繼續優化龜板有效成分的提取方法，進一步提高藥效；② 篩選龜板促BMSCs增殖、遷移、成骨分化的信號通路(單一或crosstalk)及相關基因，豐富龜板抗OP的靶點；③ 探討龜板調控干細胞內分泌/旁分泌效應及干細胞遷移/歸巢等生物學行為維持局部微環境平衡抗OP的機制；④ 借助傳統分子生物學技術和新型技術(基因芯片和高通量測序)進一步研究龜板對成骨、破骨、血管形成、膠原形成、炎癥/免疫、細胞自噬/凋亡/巨噬細胞極化、干細胞外泌體和鐵死亡等的調控機制。通過以上研究，全面詮釋龜板通過多靶點、多途徑、多層次抗OP的機制，為闡明龜板抗OP的機制奠定實驗及理論基礎。