熊果酸通過BMP-2/Smad4/Wnt/β-catenin信號通路介導對去卵巢大鼠骨量流失的保護作用

李潔 孫雅楠 解光越 李斯

1.唐山市工人醫院婦產科，河北 唐山 063000 2.唐山市工人醫院內分泌科，河北 唐山 063000 3.唐山市工人醫院骨科，河北 唐山 063000 4.唐山市工人醫院心內科，河北 唐山 063000

絕經后骨質疏松癥是由于雌激素缺乏導致破骨細胞吸收與成骨細胞形成之間的不平衡，已成為衰老發展過程中全球主要的健康問題之一[1]。減少骨吸收或增加骨形成成為治療骨質疏松癥的合適策略，旨在恢復骨骼重塑的正常平衡。目前，臨床上最常用的抗骨質疏松藥物是抗重吸收藥，如雙膦酸鹽、地諾單抗等[2]。此外，僅抑制骨吸收顯然是不夠的，特別是對于那些已經出現嚴重骨量減少的人。因此，非常需要開發新的治療藥物來治療絕經后骨質疏松癥。大量的研究報道了許多來自植物的天然化合物可預防骨質疏松大鼠的骨質流失。熊果酸(XGS)是藥材中普遍存在的三萜類化合物之一，是人類飲食中不可或缺的一部分。XGS的藥理作用包括抗癌、抗肝損傷、促分化、抗病毒、抗白血病、抗菌和抗侵襲活性[3]。富含XGS的中草藥對嚙齒動物的骨質流失具有保護作用[4]。但是，XGS對去卵巢引起的骨質疏松癥的藥理作用仍然未知。這項研究旨在評估XGS對去卵巢引起的骨質疏松癥影響及探索可能機制。

1 材料和方法

1.1 研究方案和藥物治療

30只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200～240 g，批準號：SCXK2007-007。購于北京實驗動物中心。大鼠飼養在(21±2)℃，濕度為60%～70%，光照/黑暗周期為12 h，可自由接觸食物和水。適應性喂養一周后，對大鼠進行雙側去卵巢以建立絕經后骨質疏松癥模型。將動物分為3組(n=10)：假手術組(Sham)，去卵巢組(OVX)，去卵巢+熊果酸治療組(XGS)；其中XGS組接受100 mg/kg劑量XGS(分子式：C30H48O3，批號201912，南京迪爾格醫療技術有限公司)治療。其中XGS組從術后第3天開始每天通過管飼熊果酸治療，為期12周。

禁食過夜后采集尿液樣本并通過腹主動脈穿刺采集血液，離心(2 000 r/min，20 min)收集血清。收集的尿液和血清樣本在-80 ℃冰箱保存直至使用。過量麻醉處死大鼠。解剖出雙側股骨在生理鹽水中解剖固定，-20 ℃保存，采用雙能X線骨密度儀(DEXA)測定骨密度，Micro-CT測定骨小梁微結構，三點彎曲試驗檢測骨強度變化以及蛋白印記檢測目標蛋白的表達。

1.2 骨代謝指標檢測

采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Quidel，San Diego，USA)測定血清堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)和尿脫氧吡啶啉(DPD)水平。

1.3 骨密度、骨礦物質含量和Micro-CT檢測

采用美國GE Healthcare(GE Healthcare)公司的Lunar Prodigy Advance掃描右側股骨并使用配備的小型實驗動物軟件分析和評估骨密度(BMD，g/cm2)和骨礦物質含量(BMC，g)。采用美國GE Healthcare公司的Explore Locus SP型號Micro-CT測量各組右側股骨遠端的形態計量學參數。使用15 μm3的各向同性體素大小，70 kVp的X射線管峰值電勢，114 mAs的管電流和200 ms的積分時間進行掃描，并進行高斯濾波和分段。該區域包括使用1024×1024矩陣從每個股骨獲得的350個圖像，導致各向同性體素分辨率為22 μm3。將感興趣體積(VOI)選為距股骨近端生長板25～125片的區域。采集股骨的三維(3D)圖像數據，體素大小為12 μm，所有特殊方向。根據二值化VOI直接測定骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.4 生物力學檢測

采用858 Mini Bionix材料試驗機(MTS，Eden Prairie，Minnesota，USA)對離體右股骨進行三點彎曲試驗。股骨水平放置在機器兩側支架上面，兩側支架距離為23 mm，加載方向垂直于骨的中心軸上，加載速度為2 mm/min。通過與試驗機連接的計算機專用軟件自動記錄載荷-位移曲線，得到最大載荷和彈性模量。

1.5 蛋白質印跡分析

使用RIPA緩沖液從股骨遠端組織中分離出總蛋白。用Pierce BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)測定蛋白質濃度，將20 μg蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移至PVDF膜(Millipore Corporation，Billerica，MA)上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶PBS-T緩沖液封閉1 h，然后與第一抗體以1∶1 000的稀釋度孵育2 h，但β-肌動蛋白(1∶5 000)除外。然后將膜與辣根過氧化物酶連接的二抗孵育1 h，并用ChemiImager 5500成像系統(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA)進行電化學發光。Image J軟件用于評估蛋白表達情況。

1.6 統計學分析

使用SPSS 17.0進行所有統計分析。數據用均數±標準差表示。組間差異分析采用單因素方差分析，然后進行最低顯著性差異多因素檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMD和BMC改變比較

各組大鼠股骨BMD和BMC檢測結果如圖1所示，OVX組的BMD和BMC均低于Sham組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)；XGS組的BMD和BMC均高于OVX組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠BMD和BMC改變Fig.1 BMD and BMC changes in each group注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.2 Micro-CT結果分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2 A所示，股骨干骺端的微觀參數如圖2B～F所示。OVX組左側股骨BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。XGS組左側股骨BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果Fig.2 Micro-CT test results of the metaphysis of the femur in the three groups of rats注：Sham組(a)、OVX組(b)和XGS組(c)；與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.3 股骨的生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，OVX組的最大載荷和彈性模量均低于Sham組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，XGS治療12周的大鼠股骨的最大載荷和彈性模量均高于OVX組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠股骨的三點彎曲試驗結果Fig.3 Results of the three-point bending test of the femur注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

圖4 XGS治療對骨代謝指標的影響Fig.4 Effect of XGS treatment on bone metabolism indexes注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.4 骨形成和吸收指標改變

治療12周時，OVX組ALP、OPD和OCN水平明顯升高(P<0.05)；而XGS治療后大鼠的ALP、OPD和OCN水平低于OVX組(P<0.05)。見圖4。

圖5 使用WB檢測BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin的相對表達Fig.5 Relative expressions of BMP-2, Smad4, Wnt 1, and β-catenin using Western blotting注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.5 WB檢測結果

和Sham組比較，OVX組BMP-2、Smad4、Wnt 1和β-catenin表達水平明顯下調，比較有統計學差異(P<0.05)。和OVX組比較，XGS組BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin表達水平明顯上調，比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

3 討論

在本研究中，XGS治療可以顯著改善由于去卵巢對大鼠骨密度、骨量、骨強度以及骨代謝指標影響。在這項研究中，通過大鼠雙側卵巢切除術作為骨質疏松動物模型。該模型模仿人類絕經后的骨質疏松癥，可以誘導骨質疏松癥的表現[5]。植物化合物具有用于治療或預防以骨吸收過度為特征的幾種骨疾病的藥理學應用和治療價值[6]。有研究表明，XGS通過促進骨骼形成，抑制骨骼吸收和調節骨骼代謝，對小鼠骨質疏松癥具有一定的預防作用[7]。本研究表明，基于3D骨組織形態分析，XGS可以刺激骨形成，這表明XGS可能是骨質疏松癥的潛在治療劑。

有研究表明，XGS能夠預防去卵巢引起的鈣和磷降低，并降低鈣和磷排泄的增加速率，這可能是由于鈣和磷的腸吸收和腎臟分泌增加所致[8]。DPD在監測骨吸收中起著重要作用。ALP和OCN是骨形成的生物標志物，從成骨細胞釋放到血清中并反映了成骨細胞的活性[9]。這項研究表明，XGS治療12周可顯著降低雌激素缺乏引起的骨質疏松大鼠骨轉換標記ALP、OCN和DPD水平。如預期的那樣，雙側去卵巢12周導致股骨的BMD明顯降低。同時，去卵巢手術12周股骨干骺端骨小梁Tb.N、Tb.Th和TV/BV顯著降低，而Tb.Sp明顯升高，這是松質骨丟失的典型變化。盡管XGS治療可以顯著改善上述變化，但無法完全恢復骨小梁的結構和形態。

骨質流失伴隨著骨骼重塑的顯著增加，這由骨轉換標記物ALP、OCN和DPD的水平升高所證明。XGS的治療可防止BMD的下降，這與血清ALP、OCN和尿DPD比例的下降有關。本研究進一步使用三點彎曲測試來觀察各組大鼠的骨骼的生物力學性能變化。在測試各組大鼠股骨的生物力學性能指標，包括最大負荷和彈性模量。其中，彈性模量是骨骼的內在特性的指標，而最大載荷是骨骼的外在特性的指標[10]。與Sham組相比，OVX組大鼠導致骨骼生物力學性能下降。與OVX組相比，XGS治療可大大增強其生物力學性能，這可能是由于維持了小梁的骨骼結構所致。總之，這項研究清楚地證明，去卵巢引起的骨質疏松大鼠接受XGS 治療12周可以預防骨質流失和骨小梁微結構的惡化，從而維持骨骼的生物力學能力。

屬于TGF-β超家族成員的BMP在成骨細胞分化中具有重要作用[11]。在許多BMPs家族成員中，BMP-2是關鍵信號，并且在激活后會募集磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復合物，然后將其轉入細胞核以激活Runx2的轉錄[12]。此外，經典的Wnt/β-catenin信號傳導在動物模型中通過增加骨量在調節成骨中具有公認的作用。當被激活時，Wnts引起一系列下游事件的級聯反應，從而導致β-catenin易位進入細胞核，從而啟動許多靶基因的轉錄[13]。BMP在成骨調節過程中以多種機制促進Wnt/β-catenin信號傳導[14]。本研究中OVX組的BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin表達顯著降低，而XGS治療后可以顯著上調BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin表達，這表明XGS可以激活BMP-2/Smad4/Wnt/β-catenin信號通路來保護去卵巢大鼠骨量。這些結果表明，XGS可能是去卵巢誘發的骨質疏松癥的潛在療法。這種作用的分子機制可能與BMP-2/Smad4/Wnt/β-catenin信號通路激活有關。