代謝組學(xué)在銀屑病中醫(yī)證治研究中的應(yīng)用與思考

王爍 代丹 郭娜 何春燕 樂雨馨 楊小芳 宋坪

銀屑病是一種紅斑鱗屑性皮膚病[1]，病程長，易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，中醫(yī)治療銀屑病具有較為獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)[2]，但基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面對(duì)銀屑病中醫(yī)證治研究不足，制約了中醫(yī)藥在西醫(yī)領(lǐng)域乃至國際學(xué)界的推廣應(yīng)用。代謝組學(xué)是通過考察機(jī)體受擾動(dòng)前后代謝圖譜及其變化，來研究機(jī)體整體內(nèi)部變化狀態(tài)的一種技術(shù)[3]，具備整體性、動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，本文擬對(duì)代謝組學(xué)技術(shù)在銀屑病中醫(yī)證治研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行概述，總結(jié)當(dāng)前研究成果，初步分析存在的不足及發(fā)展方向，供學(xué)術(shù)界同道參考。

1 代謝組學(xué)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用概況

目前常用的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)有核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometry,LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)等[4]。代謝組學(xué)通過檢測(cè)樣品的代謝圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，量化研究對(duì)象的生物代謝規(guī)律，找出可能與疾病、藥物等擾動(dòng)因素相關(guān)的代謝物，從而達(dá)到從整體上把握疾病狀態(tài)和藥物治療效果的目的[5]。由于其較強(qiáng)的綜合信息優(yōu)勢(shì)，與中醫(yī)學(xué)的整體觀、系統(tǒng)觀相符[6]，因而被廣泛地運(yùn)用到中醫(yī)藥相關(guān)科學(xué)問題的研究中。目前，代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究、中藥復(fù)方整體療效[7]和作用機(jī)制研究、中藥藥效物質(zhì)、中藥安全性評(píng)價(jià)等方面都取得了一定進(jìn)展，獲得了相關(guān)的生物標(biāo)記物，為中醫(yī)中藥的進(jìn)一步研究和探索提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[8]。

2 代謝組學(xué)在銀屑病中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用

證候的客觀化、量化研究是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的重要方向[9]。銀屑病的證型辨別主要依據(jù)患者的皮損特征和癥狀表現(xiàn)，但由于缺乏客觀及量化的指標(biāo)，導(dǎo)致在開展相關(guān)科學(xué)研究時(shí)難以具體操作。代謝組學(xué)通過定性定量分析，可以挖掘出與證候相關(guān)的特定性代謝組分，做到宏觀辨證與微觀生物標(biāo)志物的主客觀結(jié)合，提高銀屑病中醫(yī)辨證的科學(xué)性[10]。

2.1 銀屑病常見證型的代謝組學(xué)研究

目前，國內(nèi)學(xué)者主要對(duì)銀屑病血熱證、血燥證、血瘀證[11]三種常見證型展開代謝組學(xué)研究，探索潛在的證候相關(guān)生物標(biāo)志物。脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝紊亂及肝腎功能損害存在于銀屑病血熱證中。劉衛(wèi)紅等[12]應(yīng)用NMR譜儀技術(shù)，通過主成分分析法發(fā)現(xiàn)：血熱證銀屑病患者和健康人的代謝圖譜能夠被明顯區(qū)分，說明兩組之間存在著代謝差異。進(jìn)一步的代謝物鑒定提示，銀屑病血熱證患者血漿中脂肪酸、丙酮、乳酸、低密度脂蛋白、3-羥基丁酸、高密度脂蛋白等脂代謝產(chǎn)物，谷氨酰胺、纈氨酸等蛋白代謝相關(guān)物質(zhì)含量較健康組增高；肌酸、乙酸、膽堿等與肝腎功能損傷相關(guān)的代謝物譜峰強(qiáng)度發(fā)生了顯著的改變，為研究銀屑病血熱證的證候本質(zhì)提供了有益的信息。

陳維文[13]采用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)銀屑病血燥證和血熱證患者的代謝物，結(jié)果提示：相對(duì)于血熱證，血燥證患者膽堿、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、L-β-天冬酰胺-L-谷氨酸、硫胺乙酸、乳清苷、β-L-巖藻糖-l-磷酸鹽、泛醌-1、4-羥基丁酸明顯上調(diào)；TG(8：0/8：0/8：0)、脫氧膽酸和二十四碳六烯酸明顯下調(diào)。這些代謝物水平在兩種證型之間的顯著差異，提示其有可能成為銀屑病血燥證和血熱證的診斷指標(biāo)。

鄧靜文[14]采用LC-MS技術(shù)研究銀屑病血瘀證患者與健康人之間的代謝差異，OPLS-DA建模顯示，兩組樣本各自集中，分離趨勢(shì)明顯。代謝物鑒定得出，相較于健康人，銀屑病血瘀證患者沒食子兒茶素、4-羥丁酸明顯降低；20-羧基白三烯B4、5,6-二羥前列腺素Fla明顯增高。而以往對(duì)銀屑病血瘀證的研究多集中于血管內(nèi)皮生長因子[15]及血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)[16]，這些炎癥及神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)代謝物的發(fā)現(xiàn)，為銀屑病血瘀證的診斷與研究提供了進(jìn)一步的信息。

2.2 問題淺析

總的來說，目前代謝組學(xué)技術(shù)在銀屑病中醫(yī)證候研究中起到了一定的作用，但尚未取得較大突破。究其可能原因有二：其一，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置尚欠嚴(yán)謹(jǐn)，比如在血熱證和血瘀證的代謝組學(xué)研究中，均為銀屑病相關(guān)證型和健康人的對(duì)比，而非銀屑病不同證型之間的代謝譜比較，導(dǎo)致最后結(jié)果顯示的代謝差異是由銀屑病本身產(chǎn)生，還是由銀屑病相關(guān)證型產(chǎn)生尚不清晰；其二，結(jié)果解讀還需加強(qiáng)和中醫(yī)證候特點(diǎn)的融合。以上研究在得出銀屑病證候相關(guān)生物標(biāo)志物后，在討論中均只對(duì)相應(yīng)證候的診斷作出簡單的提示，沒有進(jìn)行真正的生物學(xué)意義的解讀。比如，血熱證中，與炎癥間接相關(guān)的脂質(zhì)類代謝物的升高，是否與血熱證的氣血燔灼狀態(tài)相吻合？血燥證的部分代謝物水平的低下，是否由其血燥傷津，能量耗竭的陰虛狀態(tài)導(dǎo)致？還有血瘀證，其抗焦慮相關(guān)介質(zhì)4-羥丁酸的異常是否與血瘀證氣血津液膠著所致的情志失調(diào)有關(guān)？這些問題都值得深入思考。目前部分研究顯示代謝組學(xué)能將不同證候的銀屑病區(qū)分開，提示了代謝組學(xué)在銀屑病證候研究中的應(yīng)用價(jià)值[17]，并且發(fā)現(xiàn)了一些迥然不同于經(jīng)典分子的代謝物，對(duì)下一步研究的開展起到重要的啟發(fā)作用。

3 代謝組學(xué)在銀屑病相關(guān)中醫(yī)療法研究中的應(yīng)用

中醫(yī)藥治療銀屑病的方法包括中藥復(fù)方內(nèi)服，以及艾灸、耳穴、濕敷等外治手段，傳統(tǒng)研究方法一般僅進(jìn)行某一靶點(diǎn)或通路的機(jī)制探討[18]。但中醫(yī)藥并非簡單地作用于某一靶點(diǎn)或信號(hào)通路，而是多組分、多靶點(diǎn)地整體作用于銀屑病的疾病狀態(tài)，使其向正常狀態(tài)恢復(fù)。代謝組學(xué)技術(shù)通過反映多個(gè)生物化學(xué)途徑的成百上千個(gè)內(nèi)源性代謝物[19]，能尋找或闡明多個(gè)作用靶點(diǎn)，進(jìn)而探討可能的作用機(jī)制，在銀屑病相關(guān)中醫(yī)療法的研究中可起到篩選靶點(diǎn)、提示未來研究方向的作用。

3.1 銀屑病相關(guān)中藥復(fù)方研究

學(xué)者們多針對(duì)已經(jīng)取得確切療效的中醫(yī)皮外科經(jīng)典方劑“涼血解毒湯”“銀屑1號(hào)方”“銀屑靈”進(jìn)行代謝組學(xué)研究，并從中發(fā)現(xiàn)了一些新的研究思路。涼血解毒湯是北京中醫(yī)醫(yī)院協(xié)定處方，是通過提煉北京地區(qū)名老中醫(yī)治療血熱證的經(jīng)驗(yàn)方藥而來，以涼血活血、清熱解毒為法擬定[20]。劉衛(wèi)紅等[12]采用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，該方能使銀屑病血熱證患者的代謝網(wǎng)絡(luò)趨于正常方向。涼血解毒湯治療后，患者極低密度脂蛋白、葡萄糖、低密度脂蛋白和不飽和脂肪酸降低，這提示該方可能通過對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)發(fā)揮治療作用。而十年前對(duì)涼血解毒類方藥的基礎(chǔ)研究，多從白介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、IL-6炎癥細(xì)胞因子方向展開[21]。這種調(diào)節(jié)糖脂類代謝物作用的新發(fā)現(xiàn)，不僅為涼血解毒類方藥的機(jī)制研究提供了新的切入點(diǎn)，還在一定程度上反映該方可能具有降低銀屑病伴發(fā)心血管疾病概率的作用[22]。

銀屑1號(hào)方是嶺南名老中醫(yī)禤國維教授的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)臨床驗(yàn)證療效確切[23]。查旭山[24]在細(xì)胞層面進(jìn)行銀屑1號(hào)方的代謝組學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)置銀屑1號(hào)血清組和生理鹽水組，制備角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)的細(xì)胞裂解液，結(jié)果顯示兩組代謝圖譜有明顯區(qū)分，銀屑1號(hào)組的醛固酮、7-去氫膽固醇等含量增高，而脫氧次黃苷、羥基苯乙酸等含量降低，其中，作為合成維生素D3重要中間體的7-去氫膽固醇水平上調(diào)，加速表皮細(xì)胞核苷酸代謝的脫氧次黃苷水平下調(diào)，體現(xiàn)了該方在細(xì)胞層面的抑制表皮增殖，增強(qiáng)正常角化的作用[25]。曲善忠[26]收集銀屑病患者尿液樣本，進(jìn)行銀屑1號(hào)方治療前后的代謝圖譜比較，發(fā)現(xiàn)治療后氧化三甲胺、肌酸、乳酸等升高，腐胺下降，其中作為細(xì)胞增殖生長因素之一的腐胺的下降，也反映了該方能調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞增殖[27]。此外，與能量代謝相關(guān)的乳酸、肌酸，以及與肝臟解毒功能相關(guān)的氧化三甲胺含量的升高，則體現(xiàn)其在調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)、糖酵解，以及改善肝功能方面的作用。雖然細(xì)胞層面和人體樣本研究得出的代謝物差異很大，但大部分代謝物指向了該方對(duì)表皮細(xì)胞增殖的抑制作用，這不僅證實(shí)了銀屑1號(hào)方對(duì)銀屑病的調(diào)節(jié)作用是多靶點(diǎn)的，還為該方的后續(xù)研究指明了重點(diǎn)方向。

銀屑靈是廣東省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，有清熱解毒、涼血活血的功效[28]。何源采用高效液相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者服用該藥后的代謝數(shù)據(jù)較服藥前更接近健康組，不僅脂類物質(zhì)甘油二酯、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、甘油三酯降低趨于正常；而且γ-谷氨酰半胱氨酸、O-磷酸蘇氨酸、黃素單核苷酸、9-順式維甲酸等維生素均明顯下調(diào)[29]，提示下一步對(duì)銀屑靈的研究可從其對(duì)脂類、氨基酸及維生素代謝的調(diào)節(jié)作用入手。

3.2 銀屑病相關(guān)中醫(yī)外治法研究

除了對(duì)治療銀屑病的經(jīng)典中藥復(fù)方進(jìn)行代謝組學(xué)研究，學(xué)者們還在耳穴外治法方面進(jìn)行初步探索，并發(fā)現(xiàn)了一些相關(guān)代謝物。有研究將銀屑病患者分為試驗(yàn)組(耳穴加得膚寶外治)和對(duì)照組(得膚寶外治)，在進(jìn)行臨床療效評(píng)價(jià)的同時(shí)，分別采集患者血清[30]和尿液[31]，進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)研究。治療4周后發(fā)現(xiàn)，臨床和實(shí)驗(yàn)層面均提示了耳穴的疊加效應(yīng)：試驗(yàn)組的銀屑病面積與嚴(yán)重性指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)改善率優(yōu)于對(duì)照組；且從兩組治療前后血清和尿液代謝譜上看，試驗(yàn)組的銀屑病代謝狀態(tài)相較對(duì)照組更趨于健康人。潛在生物標(biāo)志物鑒定顯示，兩組間可能的血清差異代謝物包括亞油酸、D-葡糖醛酸1-磷酸、12 -羥基油酸、17-羥黃體酮；兩組間可能的尿液差異代謝物包括γ-羥基谷氨酸、膽汁酸3b,12a-Dihydroxy-5a-cholanoic acid。說明耳穴貼壓療效的產(chǎn)生存在物質(zhì)基礎(chǔ)，可能與其調(diào)節(jié)糖代謝、膽汁酸代謝以及類固醇激素樣作用有關(guān)。

3.3 問題淺析

以上研究運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，通過分析治療前后代謝物的差異，提示了相應(yīng)治療手段的作用靶點(diǎn)，但同時(shí)還存在一些問題和不足：其一，目前的研究多基于臨床樣本展開，其研究過程中不可控因素很多，比如，尿液的留取是否能確保為中段尿而無其他因素的干擾；受試者的情志及生活方式對(duì)于代謝組學(xué)結(jié)果的影響也不得而知，應(yīng)建立銀屑病或銀屑病相關(guān)證候的動(dòng)物模型，開展嚴(yán)謹(jǐn)可控的基礎(chǔ)研究顯得尤為重要；其二，雖然鑒定得出相關(guān)生物標(biāo)志物，但只表明其在某個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)上起到修復(fù)作用，至于如何產(chǎn)生療效，多為基于其他研究的推論，均是初步、片面的，難以得到較明確的結(jié)論[32]，應(yīng)將癥狀體征、生化指標(biāo)等臨床數(shù)據(jù)與代謝組學(xué)信息相互驗(yàn)證、相互支撐[33-34]，并適當(dāng)納入蛋白質(zhì)印跡法和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等其他定性定量研究方法，驗(yàn)證結(jié)果并進(jìn)一步探索相關(guān)代謝通路上的其他信號(hào)分子，方能得到確切結(jié)論。代謝組學(xué)以其整體性、綜合性的優(yōu)勢(shì)，對(duì)銀屑病相關(guān)中醫(yī)藥療法的研究方向起到了提示作用，規(guī)避了盲目追蹤研究熱點(diǎn)的人力物力浪費(fèi)，并且通過代謝組學(xué)的“初篩”過程，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的治療靶點(diǎn)，為相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了線索。

4 思考與展望

代謝組學(xué)技術(shù)和方法的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景[35]，在銀屑病中醫(yī)證治研究中取得了一定進(jìn)展。但其中存在的一些問題仍亟待解決。在證候本質(zhì)研究中，尚需在完善研究方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)學(xué)對(duì)銀屑病相應(yīng)證候的理解，深入分析相關(guān)差異物及代謝通路，從而逐漸發(fā)現(xiàn)具有證候診斷價(jià)值的生物標(biāo)志物。在中醫(yī)藥療法研究中，建立動(dòng)物模型，開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，引入其他研究方法驗(yàn)證結(jié)果并進(jìn)一步探索，將有利于提供可信度更高的數(shù)據(jù)。

總之，既要繼承中醫(yī)傳統(tǒng)理論，又要全面了解代謝物相關(guān)的生物化學(xué)過程，并與其他研究方法相結(jié)合，方能充分利用代謝組學(xué)的優(yōu)勢(shì)，以期對(duì)銀屑病中醫(yī)證治相關(guān)問題的科學(xué)闡釋起到合理的推動(dòng)作用。