五味子不同組分對小鼠免疫性肝損傷的保護作用研究

王曉麗，單瑩瑩，王佳燁，李正祎，王春梅，李 賀，陳建光，孫靖輝*

(1.北華大學2017級藥學研究生班；2.吉林醫藥學院臨床檢驗基礎教研室;3.北華大學藥理教研室，吉林 吉林 132013)

肝臟損傷是導致肝硬化和肝癌的前期共同基礎，我國目前約有20%以上的人群患有不同程度的肝臟損傷。而在酒精性、化學性和非酒精性肝脂肪病變的發生發展過程中，機體免疫系統的過度應答是導致肝實質損傷的重要誘發原因[1]，因此具有調節機體免疫功能和肝臟保護雙重作用的保肝藥物具有很好的開發前景。

中藥五味子是木蘭科植物五味子的成熟干燥果實，具有豐富的藥用價值和食用價值[2]。五味子具有廣泛的藥理活性，其中對于肝臟的保護作用是其主要的功效之一。課題組的前期研究工作表明五味子有效成分對酒精性、化學性和非酒精性肝脂肪病具有明顯的保護作用[3- 5]，但對于免疫性肝損傷的研究鮮有報道。為了研究五味子有效成分對免疫性肝損傷的保肝作用，本研究建立卡介苗聯合脂多糖導致小鼠免疫性肝損傷的動物模型，觀察五味子木脂素和多糖成分對免疫性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

五味子總木脂素提取物(Schisandrachinensislignans,SCL)和五味子總多糖提取物(Schisandrachinensispolysaccharides,SCP)由吉林省五味子開發及產業化科學研究中心制備，其中SCL的提取率1.9%，純度為93.5%[3]，SCP的提取率為8.6%，碳水化合物含量為40.6%[6]；聯苯雙酯滴丸購自于北京協和藥廠；卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)購于Sigma公司；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、壞死因子(TNF- α)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、BCA蛋白定量試劑盒、干擾素(IFN- γ)與白細胞介素(IL- 6)測試盒均購于南京建成生物工程研究所。

全自動酶標儀(瑞士TECAN公司)，高速低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，FSH- 2型可調勻漿機(西安唯信檢測設備有限公司)。

1.2 實驗動物

雄性SPF級ICR小鼠，由長春市億斯實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(吉)2016-0003，體重18～22 g，飼養于12 h∶12 h晝夜循環交替動物室，室溫20～24 ℃，濕度45～55度，自由飲食飲水。

1.3 免疫性肝損傷小鼠模型的建立、分組及給藥

72只小鼠隨機分為6組，即對照組、模型組、陽性藥組、SCL組、SCP組、SCL+SCP組，每組12只。適應環境1周后，除對照組外各組小鼠均尾靜脈注射2.25 mg卡介苗(對照組注射同體積的生理鹽水)，并進行灌胃給藥，具體如下：陽性藥組給予聯苯雙酯水溶液20 mg/kg，SCL組給予SCL水溶液(0.2 mg/10 g)，SCP組給予SCP水溶液(0.9 mg/10 g)，SCL+SCP組給予SCL水溶液(0.1 mg/10 g)+SCP水溶液(0.45 mg/10 g)，對照組和模型組給予同體積的蒸餾水。連續灌胃12 d后除對照組外各組小鼠均尾靜脈注射80 μg脂多糖(對照組注射同體積的生理鹽水)。

1.4 血清生化指標的檢測

注射脂多糖8 h后，小鼠稱重，摘眼球取血，3500 r/min離心10 min，分離血清，按試劑盒說明書要求測定AST和ALT含量，運用ELISA法測定TNF- α、IL- 6和IFN- γ水平。

1.5 肝臟相關指標的測定

采血完成后，小鼠脫椎處死，摘取肝臟，稱重，取肝組織100 mg，加入9倍量的生理鹽水制成10%的組織勻漿液，3500 r/min離心10min，取上清液后按試劑盒說明書測定SOD、MDA、NO和GSH水平，計算肝臟指數。

1.6 統計學分析

所得數據均以均數±標準差表示，運用SPSS軟件(19.0版)進行分析，組間比較運用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05代表具有統計學差異。

2 結 果

2.1 各組小鼠肝臟指數和血清ALT、AST的檢測

如表1所示，模型組的肝臟指數和血清ALT、AST水平明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，而與模型組相比，聯苯雙酯組、SCP組、SCL+SCP組的肝臟指數均明顯降低(P<0.05)，SCL組雖無統計學差異，但有一定的降低趨勢，而各治療組的AST和ALT水平均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。

2.2 小鼠肝組織中SOD、MDA、NO、GSH的檢測

如表2所示，模型組小鼠肝組織中SOD和GSH水平明顯低于對照組(P<0.05)，MDA和NO水平則明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)；而與模型組相比，聯苯雙酯組、SCL組、SCP組、SCL+SCP組小鼠NO和MDA水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，SOD和GSH水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。

表 1 各組小鼠肝質量和肝臟指數的測定結果

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

表 2 各組小鼠肝組織SOD、MDA、NO、GSH水平的測定結果

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各組小鼠血清中TNF- α、IL- 6、IFN- γ的檢測

如表3所示，模型組小鼠血清中的TNF- α、IL- 6、IFN- γ水平明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，而與模型組相比，聯苯雙酯組、SCL組、SCP組、SCL+SCP組小鼠血清中的TNF- α、IL- 6、IFN- γ水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

表 3 小鼠血清TNF- α、IL- 6、IFN- γ水平

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；

與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

本研究中模型組小鼠的AST和ALT水平明顯升高。卡介苗聯合脂多糖誘導的小鼠免疫性肝損傷，可以很好地模擬肝炎病癥的免疫病理過程,是目前常用的經典免疫性肝損傷動物模型。當卡介苗進入機體后會激活T淋巴細胞，并在肝臟中大量募集巨噬細胞，再次注射脂多糖會導致巨噬細胞活化而產生一系列的炎癥細胞因子(TNF- α、IL- 6、IFN- γ)和氧自由基，細胞因子會促進肝臟炎癥的發生，而氧自由基則使肝臟出現氧化應激狀態，破壞肝臟細胞，導致肝損傷[7]。

AST和ALT存儲于肝細胞的胞漿和線粒體中，當肝細胞受到氧化損傷或者炎癥刺激時會大量從細胞中釋放，是肝損傷的重要臨床檢測指標。本研究中模型組小鼠的AST和ALT水平明顯升高，說明卡介苗聯合脂多糖誘導的小鼠免疫性肝損傷模型建立成功。另一方面，大量炎性細胞的聚集、浸潤使肝組織腫脹，表現肝臟指數顯著增加。而給予五味子各組分后AST與ALT水平明顯升高，炎性因子TNF- α、IL- 6、IFN- γ的水平明顯下降，其中SCP的作用明顯優于SCL，SCP+SCL組略有提升，表明五味子多糖是其產生肝保護作用的主要成分。

肝損傷產生的主要原因為體內活性氧過度激活和脂質過氧化的發生，過量的NO可產生大量的NO合酶，刺激肝臟進入氧化應激狀態并促使各炎癥因子的釋放[8]。MDA為脂質過氧化的最終產物，可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、壞死，能夠反映脂質過氧化和細胞損傷的程度。SOD和GSH是生物機體內重要的抗氧化酶，能很好地清除低分子自由基、過氧化氫和脂質過氧化物，二者均具有顯著的抗氧化作用。本研究結果顯示，五味子各給藥組均能顯著增加SOD的活性及GSH含量，并顯著降低了NO和MDA的含量，其中以五味子多糖最為明顯。

課題組的前期研究結果也顯示五味子多糖對酒精性和化學性肝損傷以及非酒精性肝脂肪病均有較好的保護作用，而本實驗也證實了五味子的有效成分中多糖對免疫性肝損傷的保護作用具有重要意義，而相關的作用機制需要進一步探討。