咖啡酸自微乳給藥系統的處方設計研究

王麗娜,王樹鵬,王冬梅,李校娜,郭云峰

(1.吉林醫藥學院，吉林 吉林 132013;2.吉林康乃爾藥業有限公司，吉林 吉林 132013)

咖啡酸在多種中草藥(蒲公英、山里紅、杜仲、小薊、金銀花、茵陳等)中存在,具有抗氧化、升白細胞、升血小板、抗血小板凝集、抗氧化、抗腫瘤和腦保護等多種藥理作用，且具有低毒、多效的特性，不會對人體造成損害[1]。在防治氧化應激和炎癥反應相關疾病中有廣闊的應用前景[2]。咖啡酸毒性較低，但口服吸收不好，生物利用度較低，其制劑產品常不能充分發揮藥效。此外，咖啡酸的穩定性較差，在體內易迅速轉化降解而影響療效。自微乳給藥系統作為一種新型的藥物傳遞系統，可以提高難溶性藥物的溶解度，加強藥物溶出度，并且可以避免水對不穩定藥物的水解及藥物對胃腸道的不良刺激，減少胃腸黏膜的清除和首過效應等多方面的優勢，可作為難吸收、疏水性或易水解藥物的載體。如果將咖啡酸制成自微乳，則可以達到增加藥物溶解度,改善藥物在胃腸道的吸收，進而提高生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡酸標準品(北京盛世康普化工技術研究院，批號331- 39- 5)；咖啡酸(湖北鑫鳴泰化學有限公司)；1，2- 丙二醇、鹽酸、甲醇、乙醇(均為上海凌峰化學試劑有限公司)；薄荷油(黃山天目薄荷藥業有限公司)；吐溫60、吐溫40、吐溫80、油酸乙酯、聚乙二醇400(PEG- 400)(國藥集團化學試劑有限公司)；其他試劑為分析純。

日本島津LC- 20AT高效液相色譜儀；LC- 20AT泵；LC- solution色譜工作站。ZRS- 8G型溶出度測試儀：上海書培試驗設備有限公司；KQ- 250DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TG16MW型臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；ZS90型粒度分析儀、恒溫磁力加熱攪拌器、0.45 μm微孔濾膜：津騰。

1.2 咖啡酸溶解度的測定

分別精密量取油相油酸乙酯、薄荷油、油酸和乳化劑吐溫80、吐溫60、吐溫40及助乳化劑乙醇、PEG400、1，2- 丙二醇各2 mL，加入過量咖啡酸，超聲至不再溶解，在(37.0±1.0)℃水浴恒溫振蕩48 h，得咖啡酸飽和溶液15 000 r/min離心20 min，取上清液，經0.45 μg濾膜過濾，取甲醇適當稀釋后，定容至10 mL容量瓶中。計算咖啡酸在各組分中溶解度。

1.3 油相與表面活性劑的配伍篩選

將油相和表面活性劑的質量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、4∶6、7∶3、8∶2、9∶1，在室溫下以100 r/min轉速磁力攪拌下混合均勻，加入50倍量的水，恒定轉速下磁力攪拌使之乳化，觀察乳液外觀情況，并將乳液放置過夜在觀察及記錄。按五個等級標準[3]來評價自微乳乳化效果:A.溶液呈澄清或微泛藍色乳光的微乳，乳化時間小于1 min；B.溶液略濁，呈藍白色乳光的微乳，乳化時間小于1 min；C.呈亮白色不透明液體的微乳，乳化時間1～2 min；D.色澤暗，呈灰白色，略帶油狀，時間大于2 min；E.很難乳化且一直有油滴存在，乳化時間小于2 min。

1.4 助表面活性劑的篩選

選擇乳化性能較好的薄荷油和吐溫80進行組合，分別以乙醇和PEG400為助乳化劑。在油相中分別加入助乳化劑混合均勻，再加入配伍中的乳化劑(Km值為1∶1，總質量為0.5 g)混勻觀察是否有分層現象，在磁力攪拌下滴加50倍量水，使其在蒸餾水中乳化，以體系狀態和五個等級標準為評價指標[3- 4]。

1.5 偽三元相圖的繪制

根據試驗選用薄荷油為油相，吐溫80為表面活性劑，PEG400為助表面活性劑。將表面活性劑與助表面活性劑按質量比(Km)1∶1、1∶2、2∶3、2∶1、3∶2、3∶1混合，磁力攪拌均勻，再與薄荷油按Km 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混勻，在磁力攪拌器上攪拌(100 r/min)，并進一步緩慢加入蒸餾水，考察成乳狀況，并記錄系統臨界點時油、水以及混合表面活性劑質量百分數，繪制偽三元相圖。

1.6 星點設計- 效應面法優化自微乳處方

1.6.1自微乳成乳粒徑大小

將按比例制備的不同處方的自微乳，取自制的咖啡酸自微乳，磁力攪拌，加入50倍體積的(37±0.5)℃溫度的蒸餾水，磁力攪拌均勻，0.45 μm微孔濾膜過濾后，選擇激光粒度測定儀，測定微乳的平均粒徑[5]。

1.6.2載藥量的測定

將按不同比例制備的空白自微乳，加入過量的咖啡酸，磁力攪拌均勻，加入50倍體積的(37±0.5)℃溫度的蒸餾水，磁力攪拌20 min后，15 000 r/min離心20 min，吸取上清液，用甲醇稀釋定容，45 μm微孔濾膜過濾后,紫外分光光度法測定，平行3次實驗，取其平均值[6]。

1.6.3優化自微乳處方

在偽三元相圖篩選處方的基礎上，選取對自微乳性質影響較顯著的兩個因素油相質量分數(X1)及乳化劑與助乳化劑的比值Km(X2)為考察因素，運用偽三元對Km值進行試驗，將Km的范圍定為1～3。實驗中發現油相的比例越低自微乳體系的穩定性及安全性越高，油相過高難以形成自微乳，因此將油相質量分數的范圍定10%～40%。以載藥量、粒徑為考察指標，采用星點設計- 效應面法，建立數學模型，對處方進行優化。試驗中每個因素的5水平分別記作-α、-1、0、+1、+α，其中X1、X2對應各水平的取值范圍(見表1)。

表 1 星點設計的因素水平及代碼

1.7 咖啡酸自微乳的體外評價

1.7.1外觀形態

肉眼觀察咖啡酸自微乳在25、37 ℃時，以及加入20、50、100倍量水的外觀變化。

1.7.2粒徑及分布

咖啡酸自微乳稀釋100倍后，激光粒度測定儀測定微乳的平均粒徑。

1.7.3長期穩定性考察

觀察自微乳溶液在30 d內的變化。

1.7.4體外釋放度測定

取咖啡酸自微乳，按照《中國藥典》2015年版釋放量測定法規定，采用溶出度測定法第二法(漿法)的裝置，以0.1 mol/mL、1 L為溶出介質[7]，溫度為(37±0.5)℃，轉速定為100 r/min，分別于5、10、20、30、45、60 min取樣5 mL，同時補充同體積同溫度的溶出介質。用紫外分光光度法測定不同時間點咖啡酸的含量，計算累積釋放量。

2 結 果

2.1 咖啡酸溶解度的測定

計算咖啡酸在各組分中溶解度。結果可以看出在不同乳化劑中，咖啡酸在吐溫80中的溶解度最大。在不同的油相中，咖啡酸在薄荷油中的溶解度最大。在不同的助乳化劑中的溶解度大小依次為PEG400>乙醇>1，2- 丙二醇。因此，選擇以薄荷油為油相，吐溫80為乳化劑來進行下面的處方優化實驗。

2.2 油相與表面活性劑的配伍篩選

不同油相與乳化劑的配伍，結果顯示,隨著表面活性劑與油相比例的增加,乳化效果越來越好,當比例為9∶1時,效果最好,等級為A。

2.3 助表面活性劑的篩選

結果表明以PEG400為助乳化劑時，油相與乳劑的比例為1∶9、2∶8、3∶7都能形成自微乳狀態。乙醇的乳化能力沒有PEG400的好，并且在實驗過程中發現無水乙醇太容易揮發而影響處方的穩定性。所以，本實驗確定選用PEG400為助乳化劑。

2.4 偽三元相圖的繪制

結果表明油相質量所占比例為10%～40%，Km值1～3范圍內能形成自微乳，結果見圖1。

2.5 星點設計- 效應面法優化自微乳處方

星點設計- 效應面法優化自微乳處方試驗設計及結果見表2。

采用Design- Expert 8.0.6軟件，對各個因素水平進行非線性回歸處理，得擬合方程。載藥量=33.98-1.99A-1.10B-1.27A2-1.85B2(R=0.909 7)。粒徑=16.46+3.87A+0.32B+1.82AB+5.01A2-3.72B2(R=0.891 8)。由上述方程可知，載藥量與粒徑的非線性擬合效果較好，相關系數R值都較高，說明結果具有一定的統計學意義，表明此設計模型的擬合程度較好。因此可以用此模型對咖啡酸自微乳處方進行預測、篩選和分析。

表 2 星點設計及結果

運用Design- Experts 8.0.6軟件進行擬合作圖可得效應面曲線(見圖2)。可直觀反映各因素和響應值及各考察因素之間的相互作用。根據此模型擬合得出的方程和響應面圖，可以運用Design- Experts 8.0.6的預測功能，確定咖啡酸自微乳的最優處方為：油相比例為20.37%，Km值為1.27，載藥量理論值為33.86 mg/g，粒徑理論值為12.49 nm。

2.6 咖啡酸自微乳的體外評價

2.6.1外觀形態

結果表明在25、37 ℃時均為澄清或微泛藍色乳光的微乳溶液。加入20、50、100倍量水后，形成的微乳體系顏色均為澄清透明，流動性良好。

2.6.2粒徑及分布

乳滴平均粒徑為13 nm，呈正態分布，與形態考察結果基本一致。

2.6.3長期穩定性考察

經觀察，自微乳溶液在30 d內沒有藥物析出和分層現象發生，溶液由澄清透明漸變成乳白色，咖啡酸含量無明顯變化，表明咖啡酸自微乳在30 d內穩定性良好。

2.6.4體外釋放度測定

溶出度結果表明自微乳給藥傳遞系統能提高咖啡酸的溶出度。這是因為將咖啡酸制成自微乳后，進入胃腸道的咖啡酸自微乳遇水能自發形成細小的水包油型微乳，該微乳能快速分布于胃腸道中。由于微乳粒徑較小產生巨大的比表面積，使藥物很容易透過胃腸壁的水化層，促進藥物在胃腸道的吸收。

3 討 論

自微乳給藥系統是在37 ℃輕微攪拌的條件下由油相、表面活性劑和助表面活性劑形成外觀均一透明并含有藥物的液體制劑，由于乳化劑的存在，它自發形成水包油型、粒徑小于100 nm的微乳[8]。作為一種新型的藥物傳遞系統，可以提高難溶性藥物的溶解度，加強藥物溶出度，并且可以避免水對不穩定藥物的水解及藥物對胃腸道的不良刺激，減少胃腸黏膜的清除和首過效應等多方面的優勢，可作為難吸收、疏水性或易水解藥物的載體[9]。

在自微乳處方篩選中，應盡量選擇對藥物溶解度大的油相、乳化劑和助乳化劑，以提高自微乳的載藥量。但是在實際應用中需要考慮各成分的刺激性以及之間的相互作用。因此本研究在測出溶解度的基礎上進行了配伍實驗，這可以直觀地反映各成分的相互影響結果。本研究也考察了常見的助乳化劑如無水乙醇，但在實驗操作過程中發現無水乙醇容易揮發影響處方的穩定性,所以最終選擇穩定的、乳化能力較好且無毒的PEG400為助乳化劑的用量。加入助乳化劑可以減少乳化劑的用量，達到減少對胃腸道刺激的目的，增大咖啡酸藥物在油相中的溶解度，提高自微乳給藥系統的載藥量。本研究得到的咖啡酸最佳處方，咖啡酸自微乳體外溶出較高，有利于藥物的吸收。本研究結果為進一步探索咖啡酸自微乳的體內吸收情況奠定了基礎，也為咖啡酸及以咖啡酸為主要有效成分的中藥材制劑開發提供了有利依據。