骨源性外泌體微小RNA對骨代謝的影響研究進展

郝 靜，鄧潤智

外泌體為一種類脂質膜結合的細胞外囊泡，最早是20世紀70年代通過研究綿羊紅細胞而發現的，其特指直徑為40～150 nm，密度為1.09～1.18 g/mL的囊泡。外泌體參與各種體內的細胞活動，可以從包括唾液、尿液、精液、血漿、血清、母乳和羊水在內的多種體液中分離得到。在絕大多數哺乳動物細胞培養的培養基中也能夠分離出外泌體，包括樹突細胞、上皮細胞、腫瘤細胞、免疫細胞和干細胞等，其細胞產量每天約0.5 μg/106個。外泌體重要的生物學功能是與細胞間通訊有關，在細胞間傳遞蛋白質、mRNA和微小RNA(microRNA,miRNA)等。與外泌體相關的特征性標志物包括CD9、CD63、CD81、HSP70、HSP90、肌動蛋白和膜聯蛋白等[1-4]。

骨骼系統基于不同來源細胞之間的通訊維護自身的穩定。成骨細胞和破骨細胞，分別對應著骨形成和骨吸收，在骨重塑期間協調這2種細胞的功能對于骨穩態十分重要。已知成骨細胞與破骨細胞之間存在3種信息溝通方式，分別是直接接觸、旁分泌途徑和沉積在骨基質中的生長因子。在成骨細胞與破骨細胞信息溝通過程中miRNA發揮重要作用。已經證明miRNA在骨細胞分化和功能中起關鍵作用，這些大量存在于成骨細胞和破骨細胞中的miRNA協調這2種類型的細胞在不同條件下維持骨穩態，從而影響骨發育。MiRNA除了在成骨細胞和破骨細胞的細胞內發揮作用，同時也通過細胞間的通訊發揮作用。最近，一些研究顯示骨骼相關細胞，如破骨細胞、成骨細胞、骨細胞和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)均能夠釋放外泌體。同時研究也證實了在BMSCs和成骨細胞成骨分化過程中，細胞分泌的外泌體中有miRNA的存在，并且let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b隨著成骨分化顯著增加，而miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c在外泌體中顯著降低。MiR-31在骨重塑的起始階段對破骨細胞分化具有積極作用。此外，miR-146a對成骨細胞功能起促進作用，而對破骨細胞功能起抑制作用。在老年女性的骨質疏松骨折患者和卵巢切除小鼠中均發現破骨細胞的miR-214-3p表達顯著增加。目前骨缺損修復重建的臨床研究中關于細胞移植治療是研究熱點之一，但細胞毒性和免疫原性一直是困擾研究者的問題。研究發現外泌體不表達細胞表面主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ和MHC-Ⅱ，從而避免了細胞移植和治療的缺點。同時，由于miRNA在細胞外空間中是不穩定的，外泌體可能為miRNA提供有效載荷，以保護它們免受RNases的降解、極端溫度和細胞外環境中的pH值破壞，因此，miRNA通過外泌體轉移以旁分泌的形式發揮作用是一種理想的作用形式[2,4-6]。作者主要圍繞上述內容就骨衍生外泌體miRNA在骨重建中的作用作一綜述。

1 外泌體miRNA對破骨細胞的調節作用

來源于BMSCs和成骨細胞前體的外泌體可以激活破骨細胞形成[2]，破骨細胞前體的外泌體具有促進破骨細胞分化成熟的能力。來自于破骨細胞的外泌體抑制破骨細胞生成，其機制在于來自破骨細胞的外泌體富集NF-κB受體激活劑(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)，而RANK能夠抑制破骨細胞形成。RANK水平在破骨細胞衍生的外泌體中更高，并且去除含有RANK的外泌體能夠明顯減輕破骨細胞生成的抑制作用。因此，富含RANK的外泌體可能通過與NF-κB受體激活劑的配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)競爭性結合，從而抑制破骨細胞中RANK信號通路的變化。也有研究發現，破骨細胞來源的外泌體中含有的miR-214可以使骨髓基質細胞中的巨噬細胞通過PI3K/Akt途徑促進破骨細胞生成，因而破骨細胞外泌體含有的miR-214具有導致病理性破壞性骨病的作用[4,7]。

已證明來自成骨細胞的miR-503-3p外泌體可抑制RANK表達，同時也能夠通過RANKL誘導的破骨細胞生成。有研究成骨細胞細胞系UAMS-32P釋放的外泌體含有RANKL，能夠激活RANK，從而誘導RAW264.7向破骨細胞分化。外泌體作為一種旁分泌調節劑發揮作用，介導成骨細胞和破骨細胞之間的通訊，這可能代表骨重建的一種新機制[4,8-9]。此外，miR-148a被發現在人BMSCs外泌體中上調，通過靶向MAFB基因促進破骨細胞分化，進而引起骨吸收[4,6]。

2 外泌體miRNA對成骨細胞的調節作用

來自礦化成骨細胞，以及破骨細胞和成骨細胞前體的外泌體均能夠通過促進骨生成或促進破骨細胞生成而參與骨重建。起源于破骨細胞前體的外泌體能夠激活成骨細胞分化，而破骨細胞衍生的外泌體能夠抑制成骨細胞形成[7]。

礦化成骨細胞的條件培養基具有促成骨作用，早先認為其中可能是成骨細胞分泌的酶或生長因子發揮作用。進一步的研究表明，除了分泌的生長因子和細胞因子，成骨細胞分泌的外泌體也可能發揮作用。成骨細胞前體和分化的成骨細胞的外泌體中可以檢測到let-7，具有增強骨生成的作用。破骨細胞來源外泌體中的miR-214-3p具有抑制成骨細胞骨形成的作用[2,7,10]。MiR-214被從破骨細胞外泌體中轉移到了成骨細胞，它具有抑制成骨細胞體外分化和礦化活性的作用。破骨細胞特異性miR-214轉基因小鼠的血清外泌體miR-214水平顯著升高，能夠通過ephrinA2/EphA2抑制成骨細胞活性[6-8,11]。

MiR-30d-5p和miR-133b-3p在成骨細胞衍生的外泌體中高度表達，通過靶向RUNX2基因來抑制成骨細胞分化。MiR-199b也參與了RUNX2介導的成骨細胞分化的控制。成骨細胞衍生的外泌體高表達miR-140-3p，通過抑制BMP2表達進而抑制成骨細胞的形成。此外，miR-335-3p，miR-378b和miR-677-3p在礦化的MC3T3-E1細胞中表達上調，通過抑制其靶基因而增強成骨細胞分化[6-7,11]。

3 外泌體miRNA對MSCs的調節作用

在MSCs成骨分化的過程中，細胞分泌的外泌體中miR-31表達顯著減少，作為成骨的負調節因子發揮作用，其機制為miR-31通過下調RUNX2的下游因子成骨轉錄因子Osterix和SATB2來抑制成骨分化。而對MSCs中miR-31進行抑制，具有改善骨體積和骨密度的作用。MiR-21作為成骨分化的正調節因子，在MSCs成骨分化過程中表達上調，一方面，miR-21靶向成骨分化抑制劑Spry1和Sox2發揮作用，另一方面，miR-21調節PI3K-AKT-GSK3β途徑，激活RUNX2的表達而增加MSCs的成骨[12]。

BMSCs成骨分化期間外泌體let-7a、miR-199b和miR-135b表達升高，miR-221表達降低；其中let-7可通過調節HMGA2抑制MSCs的脂肪化，進而增強骨生成和骨形成；miR-199b可能參與其中通過RUNX2控制干細胞的成骨分化。MiR-135b具有調節干細胞的成骨分化的能力，miR-135b的上調與多發性骨髓瘤患者MSCs成骨分化受損有關；miR-221的下調能夠觸發人類無限制體細胞干細胞和MSCs的成骨分化[13]。

4 外泌體miRNA的促血管生成作用

對于骨骼維持其骨量增長和發育時，必須通過形成新的血管或血管生成獲得更多的氧和營養物質。MSCs來源的外泌體的質譜分析顯示含有可溶性生長因子如血管內皮生長因子、轉化生長因子β1、白細胞介素-8，能夠刺激內皮細胞的增殖和遷移來加速促血管生成活性。除此之外，MSCs來源的外泌體含有miRNA，包括miR-210，miR-126，miR-132，miR-21和miR-6087，具有參與血管生成和誘導內皮分化的作用。來源于骨髓瘤細胞的外泌體富含大量miR-92a，在正常氧和缺氧條件下均有增強血管生成的作用。在慢性缺氧的條件下，多發性骨髓瘤細胞外泌體miR-135b也能通過靶向抑制低氧誘導因子-1改善血管生成[4,14]。

5 外泌體在骨相關疾病中的臨床研究

在小鼠的骨折愈合模型中，MSCs衍生的外泌體注射能夠增強骨折愈合。這一治療策略在修復骨質疏松癥老鼠中的臨界骨缺損中同樣有效，外泌體有效刺激BMSCs的增殖和成骨分化，并且效果隨著外泌體濃度增加而增強。最近，也有學者將人胚胎MSCs衍生的外泌體用于治療大鼠的軟骨缺損，結果顯示外泌體處理的軟骨缺陷顯示出增強的整體外觀并改善組織學評分，到12周時軟骨缺陷完全恢復[2,4,15]。MSCs分化晚期的外泌體miR-21表達顯著上升，而在體內研究模型中也證實了miR-21具有增強骨質疏松癥骨形成和加速骨折愈合的作用[12]。臨床上，在骨質疏松癥患者的血清和骨組織中發現miR-21、miR-23a、miR-24、miR-100和miR-125b均上調，表明這些miRNA可能是骨質疏松癥診斷的生物標志物以及治療靶標[16]。以上結果均提示了外泌體miRNAs在骨質疏松癥中的作用。

6 展望

外泌體是天然存在的具有細胞特異性的納米球，可以有效轉運蛋白質的成分、miRNA、mRNA和其他細胞物質至靠近和遠離細胞。骨外泌體內的特定物質提供了一種特定于細胞的機制，因此，骨衍生的外泌體可能適合用于骨再生和修復，具有調節成骨細胞、破骨細胞形成和分化的作用，與MSC相比，具有穩定性好、易保存、無免疫原性的特點，易于臨床收集和使用，未來含有特定miRNA的骨衍生外泌體有望臨床用于骨修復重建及骨代謝疾病的治療[17]。