bFGF 基因體外轉染缺血性心肌病大鼠骨髓基質干細胞研究

劉效波，荊麗杰，劉寶堂，侯文明，李磊，趙進，李子軍

濰坊醫學院附屬醫院心血管外科，山東濰坊 261031

缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy，ICM）屬于特殊或晚期階段的冠心病的一種，心肌慢性缺血主要由冠狀動脈粥樣硬化導致，心肌細胞彌漫性纖維化或壞死而形成的疾病[1]。 骨髓基質干細胞（bonemar rowstem cells，BMSCs）是一類存在于骨髓中的具有分

化成多種體內細胞潛能的細胞群， 目前是研究的熱點，可通過對特定條件的控制誘導其分化成特定細胞或組織[2]。 正是因BMSCs 的可分化形成骨、軟骨、脂肪、神經及成肌細胞的多種分化潛能，在體外增殖迅速、易獲取等特點，將其作為修復機體損傷治療用干細胞已逐漸成為研究熱點，但研究將其作為基因治療的靶細胞的卻較少[3]。該實驗擬將病毒介導的bFGF基因轉染體外培養的大鼠BMSCs，觀察bFGF 在BMSCs內表達與否及其表達率，并觀測轉染bFGF 后其細胞增殖及分化等生物學功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠10 只，體重在(180±20)g 左右，由中國醫科大學動物實驗室提供。 在恒溫（24±2）℃、12 h 循環光照的實驗環境中，在造模前喂養7 d 以適應新環境。

1.1.2 藥品和試劑 胎牛血清（Clark 公司），DMEM 培養基（Hyclone 公司），胰蛋白酶（碧云天公司），bFGF的ELISA 試劑盒（R&D 公司），bFGF 抗體（Sigma 公司）。 bFGF 片段(武漢博士德生物)，細胞轉染試劑盒(美國R&D 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ICM 模型的制備 根據文獻[4]大鼠ICM 模型的制備采用冠狀動脈左前降支結扎法。首先用水合氯醛注射液麻醉大鼠，然后通過呼吸機連接氣管對其進行插管以保持呼吸順暢。從大鼠左側的胸骨第4 根肋骨間打開胸腔以暴露心臟，冠脈左前降支走行于左心耳與動脈圓錐之間深處，利用無創小圓針7-0 絲線將心臟結扎，可見左室前壁因缺血出現紫紺，心電圖顯示ST 段弓背向上抬高。 從造模開始到造模后喂養期間，大鼠死亡數別是3 只。

1.2.2 BMSCs 的提取與培養 大鼠造模成功后斷頸處死，75%乙醇中浸泡滅菌。 后續操作均在超凈工作臺中進行。取出股骨將兩端剪除，將骨髓腔暴露。骨髓腔用PBS 緩沖液清洗3 遍，室溫下離心（1 000 rpm/min，20 min），棄上清液，加入1 mL 10% FBS-DMEM 完全培養液制成細胞懸液，將其加入培養瓶中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養， 根據細胞生長狀態每隔2～3 d 進行換液。 當細胞鋪滿培養瓶底部約80%時可進行傳代操作。

1.2.3 基因轉染 取第2～3 代的大鼠BMSCs 進行以下操作。將培養好的BMSCs 消化離心，臺盼藍染色對活細胞進行計數。于六孔板每孔中加入密度為1×105/mL的細胞懸液2 mL， 培養箱中穩定過夜， 當細胞達到60%～80%融合， 于轉染前1 天棄去原培養基換無血清培養1 d。 按轉染試劑操作說明書進行轉染。 將細胞培養皿中的原培養液吸出， 每孔加入200 μL ENI.S， 將病毒稀釋至終濃度為1×1011TU/L， 每孔加入Polybrene 至終質量濃度為5 mg/L，孵育12～24 h。 后吸棄液體，加10%FBS-DMEM 完全培養液繼續培養。

1.2.4 ELISA 法檢測bFGF 表達 6 孔板底部預先鋪好用于免疫熒光檢測的玻片， 于每孔中鋪入密度為1×105/mL 的轉染bFGF 后的BMSCs 作為轉染組，每孔加入2 mL。分別于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h分別提取1 mL 的大鼠BMSCs 培養上清液。在各時間點分別吸取1 mL 上清至事先滅菌并做好標記的EP管中 （提取后補加完全培養液1 mL），1 000 rpm/min離心15 min， 吸取上清加入新EP 管中， 編號后于-80℃超低溫冰箱保存備用。 利用ELISA 檢測bFGF 蛋白表達，試劑應按瓶上標簽說明儲存，使用前室溫平衡。對照組接種的細胞為未處理的BMSCs。后續操作參照ELISA 試劑盒說明進行。

1.2.5 免疫熒光方法檢測 將ELISA 實驗中事先鋪好的蓋玻片取出，PBS 緩沖液清洗3 次，4%多聚甲醛液固定15 min 后，再次清洗；1%牛血清白蛋白封閉30 min，按照說明書對抗體進行稀釋， 加入稀釋后的一抗bFGF 孵育100 min， 重復清洗；1%BSA 封閉30 min；加二抗孵育40 min 后清洗；DAPI 復染細胞核后清洗并封片。 操作時注意避光。

1.2.6 免疫組化染色 將BMSCs 涂片用多聚甲醛中固定30 min，封閉，加入山羊血清50μL 室溫孵育20min。再加入稀釋后的bFGF 一抗100 μL 于37℃孵育2 h，再加入通用型IgG 抗體-Fab 段-HRP 多聚體50 μL室溫孵育30 min。 DAB 溶液顯色，復染，脫水，封片后于顯微鏡下觀察。 以轉染空白質粒為正常組，以未轉染為陰性組。染染效率=（bFGF 表達陽性的細胞數/計數細胞總數)×100%。

1.2.7 CCK-8 法測增殖活性 將轉染后的BMSCs 重懸成5×103/mL 的細胞懸液以每孔100 μL 的體積種到96 孔板中作為轉染組。 培養箱中誘導24 h 后用CCK-8 試劑檢測細胞增殖能力的變化。 取出96 孔板， 以每孔10 μLCCK-8 的體積加入96 孔板中后繼續孵育2 h。 后將96 孔板置于酶標儀中在波長450 nm處讀取吸光度值（A），6 個復孔的平均值用來表示測量結果。

1.3 統計方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs 的體外培養

在培養24 h 后大鼠BMSCs 開始貼壁，逐漸開始伸展呈長梭形或者三角形，并出現小集落樣生長，d9～11 可鋪滿培養瓶底部80%左右。 經臺盼藍染色得活細胞比率約為97%。 計算細胞倍增時間約為53.6 h。通過生長曲線可知原代大鼠BMSCs 的生長期緩慢，隨后進入對數生長期并在d7～9 內持續旺盛的增殖，并轉入平臺期，增殖活力與對數生長期相交減緩并趨于穩定。 經bFGF 轉染后BMSCs 的增殖活性被進一步活化，細胞倍增時間減少，縮短至48.3 h，使細胞的增殖能力增加，細胞形態增大。

2.2 培養上清液中bFGF 濃度的測定

在不同時間點取培養上清，ELISA 法檢測其中bFGF 的分泌水平。 在60 h 時可達到最高分泌濃度，累計可達到(19.702±0.074)ng/mL，其后隨著時間增加而濃度有所下降，見表1。

2.3 免疫熒光法檢測bFGF 表達

利用免疫熒光染色對BMSCs 不同時間點表達bFGF 情況進行觀察， 結果發現在胞漿中出現較多的棕黃色顆粒，表明胞漿中有bFGF 的存在，并隨著時間推移逐漸增加，60 h 時含量最多，隨后逐漸減少，而這種濃度的變化趨勢大致類似于ELISA 法中檢測的bFGF 變化趨勢。 而空白組則無明顯的染色。

2.4 免疫組化檢測bFGF 表達

鏡下可見轉染細胞表達bFGF 呈陽性，其表達部位在胞漿，細胞胞漿染成黃褐色。 轉染組bFGF 表達率最高可達為(72.19±8.83)%， 對照組陽性表達率為(19.82±2.54)%，兩組差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組bFGF 在大鼠BMSCs 中的表達比較[（±s），%]

表2 兩組bFGF 在大鼠BMSCs 中的表達比較[（±s），%]

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別陽性率對照組轉染組t 值P 值19.82±2.54（72.19±8.83）*9.872＜0.05

2.5 CCK-8 法測大鼠BMSCs 增殖活性

轉染后的和為轉染的大鼠BMSCs 分別以每孔5×103的密度接種于96 孔培養板中培養24 h 后，CCK-8 法檢測其增殖活性。 與空白組相比，轉染組能顯著促進HUVEC 細胞增殖，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

3 討論

表1 兩組大鼠BMSCs 不同時間點bFGF 分泌水平比較[（±s），ng/mL]

表1 兩組大鼠BMSCs 不同時間點bFGF 分泌水平比較[（±s），ng/mL]

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別對照組轉染組P 值t 值12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 0.284±0.161(3.522±0.324)*9.633×10-5 15.501 0.593±0.215(5.991±0.323)*0.002 24.096 1.058±0.332(8.419±0.115)*2.965×10-6 36.146 1.977±0.123(13.014±0.313)*7.390×10-7 56.844 1.080±0.252(19.702±0.074)*7.883×10-7 122.808 0.534±0.098(11.935±0.203)*1.292×10-7 87.556

ICM 屬于冠心病的晚期階段，由于心肌缺血而引發的心力衰竭、心臟擴大的臨床癥狀，其主要臨床表現為心絞痛、心力衰竭、心律失常、血栓和栓塞，勞力性呼吸困難等[5]。 ICM 對人類健康和生活帶來嚴重影響，其發病率和致死率持續增加[6]。該實驗旨在探究體外培養大鼠BMSCs 后用病毒攜帶bFGF 轉染細胞，觀察其生物學功能的變化， 為臨床ICM 的治療提供新思路。

BMSCs 首先由Friedens tein 等于1986 年提出的具有分化成多種細胞潛能及自我更新能力的一類干細胞。 因其具有的分化潛能，通過控制特定的誘導條件，使BMSCs 向骨、肌腱、肌肉或關節等多種組織進行分化[7]。 當機體存在損傷區時，四周的BMSCs 可遷移至該區域，促進受損區域的修復或愈合。目前，基因水平的治療方案隨著基因工程技術的快速發展，被廣泛應用于在組織工程。而BMSCs 因其來源范圍廣，易得取、分離、培養和增殖，多向分化潛能，易實現自體移植， 減少異體移植的排斥反應的低或無免疫源性，易于被外源基因轉染并穩定表達等優點，已成為轉基因技術種子細胞的首選， 然而移植后BMSCs 存活率過低的問題一直未被解決[8]。 為解決該問題相關研究工作者進行了大量的研究， 結果證實低傳代接種密度、 低糖培養基和bFGF 的使用均能夠促進BMSCs的增殖[9]。 因此，在該實驗中，選取bFGF 基因對BMSCs 進行轉染。 獲取BMSCs 的方法主要包括全骨髓培養法、密度梯度離心結合貼壁培養法及流式細胞術分離法。 王雪[10]利用離心法結合貼壁培養法獲取了大量的可傳代的原代BMSCs， 經流式細胞儀的檢測CD44 陽性表達率高達99.96%，其結果與該研究一致，說明離心法結合貼壁法可用于原代BMSCs 的提取，而在該實驗中以此方法進行BMSCs 的提取且提取的BMSCs 經鑒定純度均大于99.9%可用于后續實驗。

成纖維細胞生長因子 （fibroblast growth factor，FGF）是由內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞等多種細胞分泌，有酸性和堿性兩種形式，同分異構體多樣，對多種細胞游走或增殖等生物學功能，血管新生，受損細胞的修復如軟骨與骨的愈合等均具有促進作用，在機體的創傷愈合或肢體再生中發揮重要作用[11]。 FGF可以加速病灶的產生，但從修復角度看它也有有利的一面。 FGF 具有促進細胞有絲分裂，誘導細胞的形態改變和分化的作用，在生理或病理狀態下都能夠參與機體的生長發育和組織損傷的修復過程。 bFGF 是FGF 重要組成部分，對來源于中胚及神經外胚層細胞的增殖能力具有促進作用的細胞分泌物質。 bFGF 對于BMSCs、血管內皮細胞或成骨細胞等的增殖，抑制其分化成熟，分裂及修復具有不可替代的作用。 bFGF對在極底的濃度時（低至1 ng/mL）中對胚層及神經外胚層來源的細胞任然具有強大的的促有絲分裂作用[12]，能加快BMSCs、成纖維細胞等的分裂，增殖和分化能力，因此其在組織愈合及修復中具有巨大的潛能。 研究發現濃度為1 ng/mL 的bFGF 可抑制肌肉細胞分化，抑制率可達49%，當bFGF 濃度增加至10 ng/mL時，抑制率高達80%[13]。 該實驗中bFGF 的表達隨著時間的增加含量逐漸增多， 并在60 h 累計含量達到最高，可達(19.702±0.074)ng/mL，其最低分泌濃度均>1 ng/mL，說明將其轉染入BMSCs 后能夠有效促進其增殖及分化。

表3 兩組大鼠BMSCs 不同時間點細胞增殖活性變化情況比較[（±s），%]

表3 兩組大鼠BMSCs 不同時間點細胞增殖活性變化情況比較[（±s），%]

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h對照組轉染組P 值t 值100.4±0.2（104.1±0.9）*0.002 6.951 101.9±1.5（109.8±0.5）*0.001 8.654 102.6±0.4（113.5±1.1）*8.6422×10-5 16.130 105.6±1.1（118.9±0.8）*7.126×10-5 17.342 102.7±1.0（124.3±1.2）*0.000 23.951 101.3±0.3（113.8±1.5）*0.000 14.153

病毒載體對分裂期及非分裂期細胞均具有感染作用，能使目的基因進入靶細胞并能夠穩定長期得表達，可向同一細胞引入多種基因，或對同一細胞進行對此轉染，不易引起靶細胞的免疫反應，生物學安全性也較高。 該實驗采用病毒轉染的方法操作簡單，目的基因的表達在一定的時間內保持穩定的表達。選用bFGF 基因，通過病毒轉染的方法，轉染入BMSCs 中[14]。該實驗研究發現采用病毒介導的bFGF 基因轉染大鼠BMSCs， 可在特定的時間段內持續并大量的分泌出bFGF，通過ELISA 法在12 h 即可檢測到bFGF 的表達并隨著時間的增加含量逐漸增多，并在60h 累計含量達到最高，可達(19.702±0.074)ng/mL，之后隨著時間的延長bFGF 的分泌量隨之減少，在72 h 可降低至(11.935±0.203)ng/mL， 但其分泌量均大于其最低有效濃度，即1 ng/mL，結果說明轉染在72 h 內均能保持較強的促進BMSCs 增殖的作用， 但是隨著時間的延長其分泌量逐漸減少， 故其促增殖作用也將逐漸減弱，應在一定時間內完成相關實驗，到達時間后需對細胞重新進行轉染，且轉染后作用的持續時間需進一步延長。 免疫組化結果證實bFGF 在BMSCs 中高表達且其在胞漿部位表達，說明bFGF 病毒轉染入細胞后，能在BMSCs 中得到正確而高效的表達，其中轉染的效率最高可達(72.19±8.83)%，說明大鼠BMSCs 轉染bFGF 基因的效率較高，具體實施具有一定的可行性。 與人BMSCs 的轉基因效率約為(19±1.3)%相比較[15]，轉染效率有明顯增加，增加了其作為心肌缺血疾病治療的靶細胞的可操作性。 但與張槐等[16]實驗中表達成功率達90% 以上相比較，轉染率較低，分析可能是因為轉染時的濃度或操作不熟練等問題造成，在后期實驗中將進行改進。 同時，大鼠BMSCs 轉染bFGF 基因后生長曲線也隨之變化，細胞倍增時間由53.6 h 縮短為48.3 h，細胞分裂相增多，推測其可能的原因為物種間不同而產生的差異。 與人BMSCs 倍增時間42.4 h 相比，差異性較小。 并隨著bFGF 表達的增加，導致BMSCs 的增殖活性的增加，增殖率可增加至(124.3±1.2)%， 并且可導致其形態的改變， 在bFGF 轉染組中， 細胞增殖分裂能力明顯強于空病毒組與未轉染組，該結果與張槐等人[16]結果一致，證明空病毒組無顯著增加BMSCs 的能力， 可能是bFGF 促進了BMSCs 的增殖有關。 與人BMSCs 的96%相比較而言，增殖活性明顯提高，推測可能與bFGF 分泌量相關。 因此推測對缺血的心肌組織內植入基因修飾后的BMSCs，有望其在機體內分泌較高含量的bFGF， 從而在特定時間段內發揮促進細胞增殖及分化等生物效應。此外，還可促進BMSCs 的分化成心肌組織的能力，將其作為心肌缺血疾病治療的靶細胞，在將來有望成為治療ICM 有效的治療方法。

綜上所述，通過病毒轉染的方法，成功將具有多重生物學效應的bFGF 基因轉染入大鼠BMSCs。轉染后的大鼠BMSCs 可在較長時間內保持較高濃度的bFGF 的分泌。 bFGF 基因轉染可促進大鼠BMSCs 的增殖和分化。因此，心肌基因的治療可將BMSCs 作為靶細胞，將bFGF 轉染入其中并保持長時間的分泌水平以促進BMSCs 增殖，在將來有望作為IBM 強有力的治療手段。