銀連祛風湯對慢性蕁麻疹動物模型的治療作用*

陶文靜，李曉霞，楊軍炎

1 南通漢藥中醫(yī)醫(yī)院，南通 226001；2 如皋市人民醫(yī)院，南通 226500；3 南通市第五人民醫(yī)院，南通 226361

蕁麻疹是一種常見的皮膚黏膜過敏性疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚和黏膜突然出現(xiàn)大小不等、形狀不一的風團，境界清楚，皮疹此起彼伏，發(fā)無定處，劇烈瘙癢消退后不留痕跡，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白E（IgE）介導的Ⅰ型變態(tài)反應、Th1 分泌的腫瘤壞死因子-γ（TNF-γ）等細胞因子含量降低和Th2 分泌的白細胞介素4（IL-4）等的含量升高、可能是導致慢性蕁麻疹發(fā)病的原因之一[1，2]。目前，治療慢性蕁麻疹西醫(yī)主要采用氯雷他定、依巴斯汀和鹽酸氟桂利嗪等藥物治療，但副作用大。中醫(yī)認為，慢性蕁麻疹病因多由風邪侵犯肌膚腠理導致營衛(wèi)失調(diào)；或因飲食不節(jié)，濕熱內(nèi)生，復感風邪。中醫(yī)治療由多藥組方協(xié)同增效、提高免疫力作用，從而降低發(fā)病率[3，4]。銀連祛風湯為名中醫(yī)經(jīng)驗方，臨床上用于治療慢性蕁麻疹，取得了良好的治療效果。為探討其作用機制，為臨床更廣泛應用提供依據(jù)，現(xiàn)利用慢性蕁麻疹動物模型考察銀連祛風湯的治療效果及作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

銀連祛風湯（處方：銀花10 g，連翹10 g，生石膏30 g，生地30 g，白蒺藜20 g，土茯苓30 g，茵陳30 g，地膚子15 g，地骨皮15 g，炒僵蠶15 g，丹皮10 g，生甘皮5 g。共煎煮2 次，每次煎出液200 mL），該湯劑由南通漢藥中醫(yī)醫(yī)院煎藥室提供。人（體質(zhì)量60 kg）推薦攝入量為220 g生藥·d-1，相當于3.67 g生藥·kg-1·d-1。地氯雷他啶分散片（海南普利制藥股份有限公司），人（體質(zhì)量60 kg）推薦攝入量為5 mg·d-1，相當于0.083 mg·kg-1·d-1。

1.2 試劑

卵白蛋白[默克生命科學（上海）有限公司]；氫氧化鋁（AR 級，源葉生物科技有限公司）；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；IgE、TNF-γ、IL-4 試劑盒（上海藍基生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器

Elx-800 酶標儀（美國寶特）；TGL-16C 臺式離心機（上海醫(yī)療器械廠）；HH-w21-600 恒溫水浴箱（上海醫(yī)療恒溫設備廠）。

1.4 動物

昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半；白色豚鼠，體重（350±50）g，雌雄各半。均由南通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，小鼠合格證號：SYXK （蘇）2017－046、豚鼠合格證號：SYXK（蘇）2017－045。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 方法與結果

2.1 銀連祛風湯對卵白蛋白＋氫氧化鋁誘導的慢性蕁麻疹模型小鼠瘙癢的影響

2.1.1 模型小鼠制備 取昆明種小鼠60 只，雌雄各30 只，雌性、雄性小鼠分別采用隨機數(shù)字表將小鼠分為6 組：空白組（生理鹽水）、模型組、銀連祛風湯低、中、高劑量組，陽性藥對照組（地氯雷他啶），且每組雌性、雄性小鼠各5 只。用氫氧化鋁加生理鹽水配制成氫氧化鋁懸液（1 g∶1 mL），除空白組不免疫外，其余各組小鼠腹腔注射卵白蛋白與氫氧化鋁懸液的混合液（0.1 mg＋0.1 mL）進行初次免疫，第10天再進行第二次免疫，共2 次[5]。

2.1.2 用藥方法 各用藥組小鼠在初次免疫后的第6 天開始灌胃給藥。陽性對照組的藥量為成人日均用量的10 倍，即0.83 mg·kg-1·d-1。取地氯雷他啶分散片10 片（50 mg），溶于1200 mL 水中備用。銀連祛風湯低劑量組的藥量為成人日均用量的5 倍，即18.35 g生藥·kg-1·d-1；銀連祛風湯中劑量組的藥量為成人日均用量的10 倍，即36.70 g生藥·kg-1·d-1；銀連祛風湯高劑量組的藥量為成人日均用量的15 倍，即55.05 g生藥·kg-1·d-1。將銀連祛風湯各劑量組生藥分別煎煮、濃縮、定容至1200 mL 備用。用藥組均灌胃對應品種和對應劑量的藥物，每天1 次，每天灌胃時間為上午8：00 整開始，灌胃順序依次為陽性藥組、銀連祛風湯低、中、高劑量組，模型組和空白組；均連續(xù)灌胃21 天，灌胃容量均為0.02 mL·g-1。空白組和模型組灌胃相應容量的生理鹽水。

2.1.3 小鼠模型瘙癢情況 于第二次免疫后的30 min，將各組小鼠置放于安靜室內(nèi)，觀察小鼠行為狀態(tài)。數(shù)分鐘后，小鼠會出現(xiàn)前爪搔抓頭部，嘴咬軀干，后爪搔抓軀干，嘴咬尾巴等行為，該行為類似人類抓撓皮膚瘙癢狀。記錄30 min 內(nèi)各組小鼠搔抓次數(shù)和持續(xù)時間，上述任何一動作每發(fā)生一次計作一次搔抓。結果銀連祛風湯3 個劑量組均可不同程度地減少小鼠的搔抓次數(shù)，縮短搔抓的持續(xù)時間，并呈現(xiàn)良好的量效依賴關系，與空白組和模型組比較均有顯著性差異（P<0.01）。見表1。

2.2 銀連祛風湯對抗原所致豚鼠過敏性休克的影響

取豚鼠60 只，雌雄各30 只，利用隨機數(shù)字表分別將雌性、雄性豚鼠分為空白組（生理鹽水）、模型組、銀連祛風湯低、中、高劑量組，陽性對照組（地氯雷他啶），使每組雌性、雄性豚鼠各5 只。除空白組外，模型組和各給藥組豚鼠腹腔注射1∶20 小牛血清0.5 mL。7 天后，各組豚鼠灌胃給藥，方法和劑量同“2.1”項下一致，連續(xù)灌胃21 天。灌胃結束后的當日15：00，在每只豚鼠的心臟再注入1∶20 小牛血清2 mL。注射后，將各組豚鼠置放于安靜室內(nèi)，觀察豚鼠行為狀態(tài)。1 小時內(nèi)觀察到除空白組外各組所有豚鼠均出現(xiàn)煩躁不安、前爪搔抓鼻子、頻繁打噴嚏和咳嗽等癥狀，隨即出現(xiàn)痙攣、呼吸困難、大小便失禁等癥狀，最后站立不穩(wěn)、倒地，大部分豚鼠窒息死亡[6]。實驗結果表明，各用藥組均可延緩豚鼠的發(fā)敏時間，并呈現(xiàn)良好的量效依賴關系，與模型組比較差異有顯著性（P<0.01）。銀連祛風湯中、高劑量組效果更優(yōu)，可有效降低實驗豚鼠的死亡率。見表2。

表1 銀連祛風湯對實驗小鼠瘙癢的影響（±s，n=10）

表1 銀連祛風湯對實驗小鼠瘙癢的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

表2 銀連祛風湯對實驗豚鼠過敏性休克的影響（±s，n=10）

表2 銀連祛風湯對實驗豚鼠過敏性休克的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.01。

2.3 銀連祛風湯對模型小鼠IgE、TNF-γ、IL-4 表達水平的影響

對“2.1.2”項下灌胃給藥21 天后的各組小鼠摘除眼球取血2mL，室溫下3.0×103r·min-1離心15min，分離血清備用。脫頸處死小鼠后，分別取每只小鼠血管壁組織約0.5 g，加2 mL PBS 緩沖液（不含鈣鎂）勻漿，3.0×103r·min-1離心30 min，取上清液備用。利用ELISA 法[7]檢測血清及血管壁組織IgE、TNF-γ、IL-4 含量。檢測結果表明，銀連祛風湯3 個劑量組均不同程度地降低模型小鼠血清及血管壁組織IgE、IL-4 的含量，升高TNF-γ 的含量，并呈良好的量效依賴關系；與空白組、模型組比較均有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。檢測結果還發(fā)現(xiàn)，血管壁組織中的各指標值改變更為明顯，其中高劑量組以上各指標值基本接近正常對照組（P>0.05）。見表3、表4。

表3 銀連祛風湯對實驗小鼠血清中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

表3 銀連祛風湯對實驗小鼠血清中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

表4 銀連祛風湯對實驗小鼠血管壁組織中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

表4 銀連祛風湯對實驗小鼠血管壁組織中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

3 討論

慢性蕁麻疹是皮膚超敏反應性疾病，嚴重時可出現(xiàn)全身性超敏反應，甚至過敏性休克[8]。此類反應又以Ⅰ型超敏反應為主[9]。

瘙癢是慢性蕁麻疹的主要臨床癥狀之一[10]。采用卵白蛋白＋氫氧化鋁制備了慢性蕁麻疹小鼠模型，考察銀連祛風湯緩解瘙癢癥狀的治療效果。研究表明，銀連祛風湯各劑量組均可明顯減少小鼠搔癢的次數(shù)和搔癢的持續(xù)時間，且呈現(xiàn)良好量效依賴關系。表明銀連祛風湯具有良好的止癢效果。

由于慢性蕁麻疹可發(fā)生全身性超敏反應，利用豚鼠過敏性休克模型，考察銀連祛風湯的治療效果，結果表明該湯劑各劑量組均可延緩實驗豚鼠的發(fā)敏時間，與空白對照組及模型組比較均具有顯著性差異，且呈現(xiàn)良好量效依賴關系。其中銀連祛風湯中、高劑量可降低實驗豚鼠死亡率。顯示銀連祛風湯具有良好的抗過敏作用。

既往研究認為[11，12]，慢性蕁麻疹的發(fā)生與IgE 表達水平過高有關。IgE 能夠介導Ⅰ型變態(tài)反應，通過免疫應答并釋放大量組胺等介質(zhì)，從而引起蕁麻疹的一系列癥狀。慢性蕁麻疹患者細胞免疫功能失衡也是皮膚臨床關注的熱點[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，Th1/Th2處于明顯失衡狀態(tài)是該病發(fā)病的原因之一，患者機體內(nèi)Th1 分泌的TNF-γ、IL-2 等細胞因子明顯減少，Th2 分泌的IL-4、IL-18 等細胞因子明顯增加，被認為是慢性蕁麻疹發(fā)病的基礎[15]。推測可能是Th1 型細胞因子表達水平降低，減弱了對IgE 的抑制作用，增強Th2 型細胞因子的表達，致使IgE 合成增多，促使蕁麻疹發(fā)生。因此尋找有效藥物糾正失衡的Th1/Th2 細胞因子水平是臨床治療的關鍵點[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹動物模型后，瘙癢癥狀明顯改善，血管壁組織及血清中TNFγ 含量明顯升高，IgE、IL-4 含量顯著降低，與文獻報道具有相似性[17]。此表明銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹可能與其糾正Th1/Th2 細胞因子水平相關。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血管壁組織中的各指標值改善程度要優(yōu)于血清的改善程度，高劑量組中以上各指標值基本接近正常對照組。推測是慢性蕁麻疹發(fā)病時由于血管通透性上升，表皮更易出現(xiàn)紅斑、水腫等病變。經(jīng)銀連祛風湯治療后，血管通透性隨之降低，聚集在血管壁組織中IgE、IL-4 的水平明顯下降甚至消除，TNF-γ 水平代償性升高，并彌補其功能上的不足。而外周血由于全身循環(huán)的緣故，異常細胞因子的徹底改善會相對緩慢，出現(xiàn)了時間窗，類似人類慢性蕁麻疹皮損已消除，但如不鞏固治療會出現(xiàn)反復發(fā)作現(xiàn)象。

祖國醫(yī)學稱蕁麻疹為“癮疹”，風邪侵襲是主要病因，兼有寒邪或熱邪，氣血不足，濕熱內(nèi)蘊，病程拖沓，皮膚瘙癢為疾病主癥。銀連祛風湯處方中銀花、土茯苓清熱除濕，生地、丹皮涼血養(yǎng)陰，同為君藥，四藥合用共奏清熱、涼血、消風之功效；連翹、石膏清熱瀉火，為臣藥；白蒺藜與地膚子合用增強熄風止癢之功；茵陳清熱利濕；炒僵蠶息風止痙，祛風止痛；地骨皮清肺降火；生甘皮理氣降逆。全方合理配伍，共奏祛風清熱、涼血消風、潤燥通里之功。綜上所述，慢性蕁麻疹的病因?qū)W說和銀連祛風湯的組方原理異曲同工，并被本研究佐證。

4 結論

本研究探討了銀連祛風湯對慢性蕁麻疹動物模型的治療作用與相關機制，發(fā)現(xiàn)該湯劑能減少小鼠搔抓次數(shù)和搔抓的持續(xù)時間，明顯延緩實驗豚鼠的發(fā)敏時間，顯示其具有良好地止癢和抗過敏作用。研究還發(fā)現(xiàn)，銀連祛風湯能使模型小鼠血管壁組織及血清TNF-γ 含量明顯升高，IgE、IL-4 含量顯著降低，而且血管壁組織中的以上各項指標值的改善程度要優(yōu)于血清的改善程度。表明對血管壁組織及血清細胞因子的調(diào)節(jié)作用可能是銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹的作用機制之一。因此本實驗結果為銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹提供了重要的實驗依據(jù)。