甘麥大棗湯對焦慮型腸易激綜合征大鼠行為學和腸組織中5-HT、SP、CGRP、TNF-α 的影響研究*

朱 靜，孫 峰，朱 華**，甘 瑜，陳 旭，3

1 江蘇省蘇北人民醫院，揚州 225001；2 揚州大學醫學院，揚州 225001；3 大連醫科大學 藥學院，大連 116044

腸易激綜合征 （irritable bowel syndrome，IBS）是臨床上常見的胃腸道功能性疾病，屬于世界級難治性疾病之一，患者以反復發作的腹痛、腹瀉為主要臨床表現[1]。IBS 病理機制復雜，其常與多種腸道神經信號傳導因子神經肽以及炎癥因子相關，如5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）、P 物質（substance-P，SP）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP） 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[2]。臨床研究發現，焦慮抑郁均是其常見的誘發因素和伴隨癥狀，單純胃腸動力調節藥物對IBS 的療效有限[3]，目前中藥組方治療IBS 的研究報道以調和肝脾、補脾柔肝的抗抑郁較為多見[4-7]，而對焦慮型IBS 及其對癥治療的藥物研究較少。

甘麥大棗湯為經典的中藥安神劑，具有和中緩急、養心安神的功效，主治心陰不足、肝氣失和的臟躁證，即更年期綜合征、神經衰弱、焦慮等。IBS 的焦慮癥狀也是甘麥大棗湯的適應癥之一，臨床已有類似應用和研究[8-10]。

本研究通過觀察甘麥大棗湯對IBS 模型大鼠的腸組織病理形態和體內5-HT、SP、CGRP、TNF-α的影響，初步探討甘麥大棗湯治療焦慮型IBS 的作用機制。

1 材 料

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD 大鼠70 只，重量為（210±20）g，購自揚州大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SYXK（蘇）：2017-0044。飼養條件：室溫（25±2）℃，相對濕度為50%±10%，每日交替12 h 光照，自由飲水。

1.2 實驗藥物

甘麥大棗湯提取物為本實驗室自制：炙甘草飲片 （Glycyrrhizae uralensis Fisch.）、小麥飲片（Triticum aestivum L.）、大棗 （Zizyphus jujube Mill.）均購自康美藥業股份有限公司，按9∶15∶26 比例設方，共計1000 g，10 倍水煎煮3 h，煎煮兩次，合并兩次藥液，減壓濃縮至1 g·mL-1備用。番瀉葉（Cassia angustifolia Vah.） 購自康美藥業股份有限公司。取番瀉葉500 g，10 倍水煎煮3 h，煎煮兩次，合并兩次藥液，減壓濃縮至1 g藥材·mL-1備用；鹽酸洛哌丁胺（西安楊森制藥有限公司），用生理鹽水配制成0.05 mg·mL-1混懸液備用。

大鼠5-HT 酶聯免疫試劑盒 （貨號：JM-01839R1）、大鼠SP 酶聯免疫試劑盒 （貨號：JM-01851R1）、大鼠CGRP 酶聯免疫試劑盒（貨號：JM-02058R1）、大鼠TNF-α 酶聯免疫試劑盒（貨號：JM-01587R1），均購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 儀器

CPA225D 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Infinite M200 Pro 型酶標儀(上海帝肯貿易有限公司)；電子分析天平 （德國Sartorius 公司）；高速低溫冷凍離心機（湘儀TGL-20M）。

2 方 法

2.1 建立IBS 模型

從70 只SD 雄性大鼠隨機取10 只作為空白對照。剩余60 只建立焦慮恐懼模型，給予大鼠條件性刺激程序：噪音刺激3 h·d-1；足底電擊：間歇30 s 電擊2 s，1 h·d-1；夾尾刺激：束縛3 h·d-1和番瀉葉提取物1 g·mL-1灌胃2 mL，持續15 d。以腹瀉和高架十字法為標準評價模型，觀察實驗大鼠出現腹瀉癥狀。以模型大鼠進入開放臂時間 （open arm time，OT）和進入開放臂次數（open arm entry，OE）在總時間和總次數統計中OT%<20%和OE%<25%，則認為焦慮模型成功（42 只被判定為成功），剔除高架十字篩選造模不合格的大鼠。

2.2 實驗分組

設正常的SD 雄性大鼠為空白組A；焦慮模型大鼠隨機分為5 組，每組8 只：IBS 模型組B、陽性藥組（鹽酸洛哌丁胺0.5 mg·kg-1）C、甘麥大棗湯低劑量組（每天一次，10 mL·kg-1）D、中劑量組（每天2 次，10 mL·kg-1）E、高劑量組（每天3 次，10 mL·kg-1）F。

2.3 實驗方法和樣本的取材方法

2.3.1 行為學評價實驗 繼續維持對模型的刺激，同時按計劃給藥，持續15 d。最后一次給藥前6 h 對各組大鼠進行高架十字法的焦慮評價，統計給藥前后OT%和OE%。

2.3.2 腸推進實驗與血清處理 末次給藥1 h 后給各組動物灌胃10%活性碳與5%阿拉伯膠混懸液（劑量10 mL·kg-1），30 min 后將實驗大鼠行異氟烷麻醉、腹主動脈取血5 mL 于干燥管內，4 ℃靜置1 h、4 ℃低溫3000×g 離心20 min，分離出血清；編號后迅速完成5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平的ELISA檢測。

將大鼠脫頸處死，剝離胃腸道，放置于平板上，測定幽門至碳墨前沿的距離，以及幽門至回盲部全長，使用公式計算腸推進百分率。

腸推進百分率（%）=炭墨前端與幽門的距離/小腸全長×100%

2.3.3 制備腸組織勻漿液和組織病理切片 分離大鼠結腸組織，PBS 沖淋洗掉黏連血塊，稱重約0.2 g，加1.8 mL PBS 緩沖液將腸組織勻漿，制得約10%組織勻漿液，4 ℃低溫、5000×g 離心10 min；取上清液編號后4 ℃冷藏備用，并取大鼠結腸組織PBS 沖淋洗掉碳墨及其他污染物，多聚焦浸泡脫水，做HE染色病理切片，觀察各組病理學變化。

2.3.4 ELISA 法檢測血清和腸組織中的5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平 采用酶聯法 （ELISA），按照ELISA 試劑盒說明書所提供的標準程序，對各實驗組所采集的血清樣本和腸組織樣本的PBS 溶液進行5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平測定，酶標儀測定吸光度，并計算出含量結果。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 甘麥大棗湯對IBS 模型大鼠焦慮行為的影響

與模型組相比，甘麥大棗湯能顯著降低IBS 大鼠焦慮樣行為，中、高劑量組作用顯著，陽性藥組作用不顯著，見表1。

表1 甘麥大棗湯對IBS 大鼠焦慮樣行為的影響（±s）

表1 甘麥大棗湯對IBS 大鼠焦慮樣行為的影響（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，給藥前后比較，△P＜0.05。

3.2 腸推進率測量

與空白組對比，模型組腸推進率顯著增加，陽性藥組對IBS 模型的腸道作用顯著，甘麥大棗湯可抑制IBS 的腸推動作用，但作用較陽性組弱。見表2。

表2 甘麥大棗湯對IBS 大鼠腸推進的影響（±s）

表2 甘麥大棗湯對IBS 大鼠腸推進的影響（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 HE 病理結果

與空白組對比，模型組和陽性對照組大鼠結腸組織中出現腸組織水腫的病變反應，從甘麥大棗湯低劑量組中可見部分水腫反應，高劑量組和中劑量組病理組織中水腫病變明顯減少。見圖1。

3.4 腸組織中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平

與空白組對比，IBS 模型組腸組織中SP、CGRP和TNF-α 水平均明顯提高；各給藥組與模型組相比均可不同程度降低大鼠腸組織中SP 和CGRP 含量，但甘麥大棗湯對血清中5-HT 和TNF-α 作用不顯著，與IBS 模型組無顯著差異，見表3。

表3 甘麥大棗湯對大鼠結腸組織中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

表3 甘麥大棗湯對大鼠結腸組織中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.5 血清5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平

與空白組相比，IBS 模型組血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平均明顯提高；甘麥大棗湯3 組與模型組相比，均可不同程度降低大鼠腸組織中5-HT、SP 和CGRP 含量，但對TNF-α 作用不顯著，與IBS 模型組無顯著差異，見表4。

表4 甘麥大棗湯對大鼠血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

表4 甘麥大棗湯對大鼠血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

腸易激綜合征不僅是一種慢性腸道功能紊亂性疾病，也是一種心身疾病，又稱為腸神經官能癥。據研究發現，我國IBS 發病率為5%～12%[11]，IBS 發病原因復雜，涉及胃腸道動力調節障礙、內臟感覺過敏、腸道炎癥和免疫反應、精神心理因素、遺傳等。臨床中有42%～61%的患者存在心理障礙，常表現為廣泛性焦慮、情緒低落、驚恐，同時表現出一定的軀體障礙[12]。焦慮與抑郁是最常見的精神心理障礙癥狀，發病機制涉及多個神經營養因子、神經遞質，如5-HT、SP、CGRP 等[13]，以及下丘腦-垂體-腎上腺軸功能等。研究證實，精神心理因素是IBS 發病和治療的關鍵[14]。

腸易激綜合征是腸神經系統在內臟敏感和腸道動力調節紊亂等多因素所致的疾病，隨著對IBS病理機制的深入研究發現，腸道平滑肌運動相關的神經調節因子以及一些炎癥因子與IBS 的發生有關聯性。5-HT 又叫血清素，是一種參與內臟感覺和動力調節的神經遞質，主要分布于腸黏膜嗜鉻細胞，血小板和腦組織也有少量分布，可以調節平滑肌張力，是腸道肌肉收縮力的重要來源，可以促進胃腸壁收縮，在IBS 患者的血清中5-HT 水平顯著高于健康人群，同時，腸道中5-HT 的表達升高也伴隨著嗜鉻細胞的活躍程度增強，進而發生嗜鉻細胞反饋合成并分泌大量5-HT，促進腸道蠕動，提高內臟敏感性，是IBS 發生泄瀉的重要病理因素[15]。SP 對腸道具有增強胃腸蠕動、增加消化道平滑肌收縮，并具有刺激腸黏膜血管舒張，增加腸道分泌水和電解質的作用[16]。SP 的異常升高可使腸道平滑肌強烈收縮、增強結腸集團運動的作用，這與IBS 患者的腹痛和腹瀉的癥狀密切相關。CGRP 的主要生理作用是促進胃腸道血流、分泌及運動功能，也可以介導痛覺的傳遞[6]。通過改變局部血流、調節平滑肌的收縮及肥大細胞脫顆粒，CGRP 可使內臟感覺的傳入信號發生改變，可能與腸易激綜合征患者的胃腸動力異常和腹痛有關[7]。IBS 患者長期腹痛和腹瀉常伴有腸道的炎癥反應，TNF-α 能阻止內毒素休克、有抗感染效應，是IBS 患者重要的炎癥介質指標[17]。

中醫學認為肝脾不調、脾失健運以及肝郁氣滯是IBS 的主要病機，如《素問·藏器法時論篇》曰:“脾病者……虛則腹滿腸鳴，飱泄不化。”還可因為飲食不節、外感時邪、情志失調、素體陰虛或陽虛，這些因素致使臟腑氣血失調，出現氣滯、血瘀，寒、濕、熱等內生的一系列病理過程。辨證該病：其表現雖以脾胃為主，但病因多在肝失疏泄、肝木乘脾，致脾失健運而起。肝病多涉及人身情志，情志受到肝的疏泄功能的調節，情志不遂，肝失疏泄、肝郁氣滯，則導致脾胃和腸氣機郁滯升降失常，出現類似IBS 的腹痛、腹瀉、便秘等癥狀。臨床治療除運脾化濕、調和氣血外，還宜配合使用疏肝解郁、養心安神的方法來治療腸易激綜合征患者的抑郁、焦慮癥狀，對整體病癥也有顯著的療效。甘麥大棗湯來自《金匱要略》，由甘草、小麥和大棗組方，具有補益心脾、寧心安神之功效，主要治療因憂思過度、心神失養所致的的臟躁證，被廣泛用于抑郁癥、焦慮癥的治療，具有一定的療效[18]和良好的開發潛力[8，9]。

本研究采用慢性應激誘發大鼠出現焦慮癥的同時，刺激腸道平滑肌出現腹瀉達到與IBS 相同的綜合癥狀。經過15 天的模型刺激，以高架十字法篩選同時符合焦慮和腸易激特征的大鼠，然后再分組比較甘麥大棗湯對模型大鼠的干預作用。通過高架十字法的行為學實驗發現，甘麥大棗湯可以顯著改善IBS 大鼠的焦慮樣行為，對IBS 大鼠的腸推動亢進也有一定的抑制作用。陽性對照藥雖然對腹瀉和腸推動的作用顯著，但不能改善IBS 模型的焦慮表現。

本研究分析發現，甘麥大棗湯對IBS 模型大鼠腸組織和血清中異常升高的5-HT、SP、CGRP 均有明顯降低作用，而對TNF-α 作用效果不顯著。說明腸道炎性反應可能不是甘麥大棗湯的作用位點，而甘麥大棗湯在調節其他重要的腸道神經遞質和中樞系統及抗焦慮抑郁狀態密切，對相關細胞因子水平的作用較顯著，可能是其治療IBS 的重要機制之一。

5 小 結

綜上所述，甘麥大棗湯對焦慮型IBS 大鼠的行為學和腸生理功能均有積極作用，可顯著改善IBS大鼠的焦慮樣行為，抑制腸道蠕動的亢進，并且降低腸組織中5-HT、SP、CGRP 水平，而對腸道炎性因子作用較弱。