丹七片對氣滯、氣虛以及寒凝血瘀模型大鼠的治療作用研究

曲笑鋒 ，于艷輝 ，唐曉桐 ，吳 萍 ，王雅儷 ，王明鑫 ，蔡秀華 ，趙伯友

（1.吉林修正藥業新藥開發有限公司，吉林省中藥標準化關鍵工程技術重點實驗室,長春130103；2.修正藥業集團股份有限公司，通化134100）

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

丹七片，淺黃棕色薄膜衣片，批號：20180705，由修正藥業集團股份有限公司提供，實驗前研磨成粉，0.4%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，濃度分別為0.675、1.35、2.7 g/kg （相當與臨床成人用量的 1、2、4 倍），4℃保存備用；鹽酸腎上腺素注射液，購自天津金耀藥業有限公司，批號：1805201；復方丹參滴丸，棕色薄膜衣滴丸，批號171222，天士力制藥集團股份有限公司生產，實驗前配制成濃度含生藥0.1548g/kg混懸液，4℃保存備用。

1.2 動物

SPF級Wistar大鼠180只，雌雄各半，體重200~220g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。生產許可證編號：SCXK（吉）-2016-0003。

1.3 試劑

羧甲基纖維素鈉：國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181009；醫用酒精：德州德新康消毒制品有限公司，批號：150809；肌酸激酶（CK）ELISA 檢測試劑盒，生產批號：JL21154；肌酸激酶同工酶（CK-MB）ELISA檢測試劑盒，生產批號：JL12296；Na+-K+-ATP酶ELISA檢測試劑盒，生產批號：JL11832；內皮素-1（ET-1）ELISA 檢測試劑盒，生產批號：JL10931；一氧化氮（NO）ELISA檢測試劑盒，生產批號：JL13431。均購自上海將來實業股份有限公司。

1.4 儀器

酶標儀，廠家：Manufactured in China Designed in California USA，型號：SMP500-18272-LSIO；全自動血液流變儀，廠家：北京普利生儀器有限公司，型號：LBY-N6；電子天平，廠家：美國雙杰兄弟有限公司，型號：T1000。

1.5 方法[1]

1.5.1 分組給藥

取檢疫合格的Wistar大鼠60只，雌雄各半。隨機設立6個實驗組，分別為空白對照組、模型對照組、復方丹參滴丸組（陽性組）以及丹七片高、中、低（2.7、1.35、0.675 g/kg/d）劑量組，每組10只大鼠，雌雄各半，給藥組給予相對應藥物，模型對照組給予純化水，各組動物均每天灌胃給藥1次，給藥體積為10mL/kg。

1.5.2 模型制備

氣滯血瘀模型：給藥組連續給藥1周，除空白對照組外，其余各組分別于給藥0.5h后給予鉗尾刺激，每次維持10min，每隔2h鉗尾一次，一天4次，連續剌激一周。第2周于給藥半小時后行鉗尾刺激，每次維持10min，每隔1小時剌激1次，每天鉗尾8次，于第4次鉗尾之后皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg（與生理鹽水1∶3），間隔4小時后再次注射鹽酸腎上腺素，空白對照組注射生理鹽水，如此連續刺激1周[2]。

氣虛血瘀模型[3～4]：給藥組連續給藥1周，除空白對照組外，其余各組每日游泳至力竭(以頭沉入水中5～10s為準)連續7d制備氣虛血瘀模型。空白對照組從實驗開始至結束正常飲水、喂食。各組動物在實驗第7 d下午禁食不禁水12 h，第8 d上午，除空白對照組外，其余各組均皮下注射鹽酸腎上腺素注射液(0.8 mg/kg)制備模型，注射1 h后開始取材。

寒凝血瘀模型[5～6]：將碎冰放入水深 15～20 cm 內壁光滑的塑料圓桶中，待冰水溫度至0～1℃，除空白對照組外，將各組大鼠放入圓桶，10 min后，將全身僵直大鼠取出。每天冰水浴后給予鼠糧正常飼養，各組大鼠每天按照上述造模方法造模，連續造模10d。實驗開始1~5d只造模不給藥，5~10d給藥組給予相對應藥物。

1.5.3 檢測指標

檢測時間：試驗結束解剖當天；

檢測動物：各組待解剖動物；

采血方法：樣本采集前所有動物禁食至少12小時但不禁水。經1.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉 （腹腔注射1.5mL/kg）后自腹主動脈采血約3.0 mL用于血流變學檢測，約2mL用于血清生化學指標檢測。

血樣處理方法：血流變學檢測將血液置于枸櫞酸鈉抗凝管，立即檢測；血清生化學指標檢測將血液3000r/min離心10min，取上清液置于-20℃冰箱保存備用。

具體檢測指標：全血黏度（低切、高切）；ELISA法檢測血清中肌酸激酶 （CK）、肌酸激酶同工酶 （CKMB）、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶（Na+-K+-ATP）、內皮素（ET-1）和一氧化氮（NO）。

1.5.4 統計學方法

所有數據用SPSS13.0統計軟件處理，計數資料組間比較采用t檢驗分析法，結果以均數±標準差（x±SD）表示，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 動物一般狀態觀察

三種血瘀模型動物造模前，各組大鼠發育正常，皮毛有光澤，無脫毛等現象；自主活動正常；大小便無異常；攝食、飲水正常；對外界刺激反應靈敏。表明所選Wistar大鼠符合實驗要求。

造模后，均出現皮毛無光澤，豎毛，脫毛，以及不同程度稀便現象，以模型對照組最為嚴重，并且氣滯血瘀模型中，除空白對照組外其余各組大鼠存在不同程度廝打所致傷痕。陽性組、丹七片高、中劑量組體質量下降不明顯，一般狀態良好，其次為丹七片低劑量組。

2.2 丹七片對三種血瘀模型大鼠血流變學的影響

三種血瘀模型對照組與空白對照組比較，全血黏度（低切、高切）均有明顯差異（P<0.05，P<0.01）。氣滯血瘀模型陽性組、丹七片高、低劑量組與模型對照組比較全血黏度（高切）均有明顯差異（P<0.05）；氣虛血瘀模型與模型對照組比較，丹七片高劑量組全血黏度 （低切、高切）有明顯差異（P<0.05），陽性組全血黏度（高切）有明顯差異（P<0.05）；寒凝血瘀模型陽性組、丹七片高劑量組與模型對照組比較全血黏度（低切、高切）均有明顯差異（P<0.05），丹七片中、低劑量組與模型對照組比較全血黏度（低切）均有明顯差異（P<0.05），詳見表1。

2.3 丹七片對三種血瘀模型大鼠血清生化學指標的影響

2.3.1 氣滯血瘀模型

模型對照組與空白對照組比較，各項指標均有極明顯差異（P<0.01，P<0.001）；與模型對照組比較，陽性組、丹七片高劑量組NO、Na+-K+-ATP含量明顯升高（P<0.05），CK、CK-MB、ET-1 含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001），丹七片中劑量組除 NO、Na+-K+-ATP外其余各項指標均有明顯降低 （P<0.05，P<0.01，P<0.001），Na+-K+-ATP 含量有明顯升高（P<0.05），丹七片低劑量組CK、CK-MB含量均明顯降低 （P<0.05，P<0.01），詳見表 2。

表2 丹七片對大鼠氣滯血瘀模型相關指標的影響（x±SD）

2.3.2 氣虛血瘀模型

模型對照組與空白對照組比較各項指標均有顯著差異（P<0.01，P<0.001）；與模型對照組比較，陽性組各項指標均有明顯差異（P<0.05，P<0.01，P<0.001），丹七片高、中、低劑量組除NO外各項指標均有不同程度升高或降低， 且具有統計學意義 （P<0.05，P<0.01，P<0.001），詳見表 3。

表3 丹七片對大鼠氣虛血瘀模型相關指標的影響（x±SD）

2.3.3 寒凝血瘀模型

模型對照組與空白對照組比較，各項指標均有明顯差異（P<0.01，P<0.001）；陽性組與模型對照組比較，除ET-1外，其余各項指標均有明顯差異（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；丹七片高劑量組與模型對照組比較，各項指標均有明顯差異（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；丹七片中劑量組與模型對照組比較，NO含量明顯升高（P<0.01），CK、CK-MB 含量均明顯降低（P<0.05，P<0.001）；丹七片低劑量組與模型對照組比較，NO含量有明顯升高（P<0.05，P<0.01），CK 含量明顯降低（P<0.001），詳見表4。

表4 丹七片對大鼠寒凝血瘀模型相關指標的影響（x±SD）

3 討論

CK是一種與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶。CK活性測定可以用于骨骼肌疾病及心肌疾病的診斷。CK-MB在臨床診斷中也有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發生時，人血清中CK水平迅速提高，認為在心肌梗塞的診斷中測定CK的活性比做心電圖更為可靠，其中CK的同工酶CK-MB診斷的特異性最高。

血瘀證是臨床常見的病癥，其發病是由于多種致瘀因素導致血行緩慢、脈道壅塞而致。根據致病因素不同，可分為寒凝血瘀、氣滯血瘀、氣虛血瘀等類型，病變可累及心、腦、肺、腎、肝、生殖等多個系統，輕者可影響患者的日常生活，重則危及患者生命[7]。因此，對血瘀證及活血化瘀藥物的相關研究是中醫臨床與理論研究中最受國內外關注的領域之一[8]，對降低由于血瘀引起的各類病癥諸如心腦血管疾病的發生率和死亡率具有重大意義。血瘀證由于病因不同，其處方用藥也不盡相同，因此對血瘀證不同證型的研究，更具臨床意義。本研究以此為出發點，意在探究丹七片對不同血瘀證的治療作用，明確其療效，為臨床用藥提供保障。根據中醫學“氣溫則血滑，氣寒則血凝”、“氣結則血凝”、“氣虛則血瘀”等病因理論，本實驗采用持續性鉗尾刺激、游泳力竭以及冰浴聯合腎上腺素注射復合因素制備三種血瘀的大鼠模型。結果顯示，造模后模型組大鼠出現體質量明顯減輕、懶散倦怠、毛色枯黃、稀便等血瘀的證候，符合中醫學宏觀指標。同時通過血流變學檢測全血黏度的增高，也提示了血瘀模型微觀指標的出現[9]。

丹七片為理血劑，具有活血化瘀，通脈止痛之功效。用于瘀血閉阻所致的胸痹心痛，眩暈頭痛，經期腹痛。方中以丹參微寒，活血養血，化瘀通脈；三七性溫，活血止血，祛瘀定痛。二者合用可增加冠狀動脈血流量；改善心肌收縮力，調整心率，調節血壓；改善微循環系統，抑制血小板凝聚；降低血漿粘稠度，增加纖維蛋白溶解，是治療心脈瘀阻、胸痹絞痛的良藥[10～12]。本實驗結果顯示，丹七片給藥組可降低三種血瘀模型的全血黏度（高切、低切），以高劑量組效果最為顯著可能與抑制紅細胞變形性等因素有關[13]。與空白對照組比較，模型對照組三種血瘀模型的各項指標均有顯著升高或降低。與模型對照組比較，三種血瘀模型丹七片高劑量組的各項指標均有明顯升高或降低，且具有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）； 丹七片中、 低劑量組 CK、CK-MB等主要指標有明顯升高或降低 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。本研究獲得結論：丹七片能夠降低氣滯、氣虛、寒凝血瘀模型大鼠的全血黏度，并可通過調節CK、CK-MB、Na+-K+-ATP等相關指標抑制三種血瘀的發生和發展，為丹七片的臨床用藥提供理論保障。